非洲猪瘟病毒快速检测新突破：蓝色乳胶微球免疫层析试纸条

为防控非洲猪瘟（ASF），研究人员制备单克隆抗体建立检测试纸条，灵敏度高、特异性好，助力疫病诊断。

　　非洲猪瘟，一个让养猪业谈之色变的 “恶魔”。自 1921 年在肯尼亚被首次发现后，它不断 “迁徙”，给全球养猪业带来了沉重打击。2018 年，非洲猪瘟首次在中国辽宁沈阳出现，随后迅速蔓延至多个省份，造成大量生猪死亡，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。更糟糕的是，非洲猪瘟病毒（ASFV）不断变异，从最初的高致病性基因型 II 毒株，到后来出现的低致病性突变株以及基因型 I 和 II 的重组株，这使得防控难度不断加大。

目前，针对非洲猪瘟，既没有有效的疫苗，也没有治疗药物。在这样的困境下，快速、准确的诊断方法就显得尤为重要。实验室常用的 PCR 和 ELISA 技术，虽然准确性高，但需要特定设备和专业人员操作，无法满足现场快速检测的需求。免疫层析试纸条检测技术操作简便、无需设备，适合现场检测，成为了研究的热点方向。

华中农业大学的研究人员针对非洲猪瘟病毒展开了深入研究，他们的研究成果发表在《AMB Express》上。这项研究对于非洲猪瘟的防控具有重要意义，为疫病诊断提供了新的技术手段，有望帮助养殖户及时发现疫情，减少损失。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：

1. 基因工程技术：合成 ASFV 的 CP204L 基因片段，构建重组质粒并转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) 中，实现 p30 蛋白的原核表达。
2. 单克隆抗体制备技术：以重组 p30 蛋白为免疫原，免疫 BALB/c 小鼠，经过细胞融合、筛选和亚克隆，获得稳定分泌抗 p30 单克隆抗体（mAb）2A5 的杂交瘤细胞株。
3. 抗原表位鉴定技术：设计一系列 p30 截短蛋白，通过 Western blot 和间接 ELISA 技术，确定 mAb 2A5 识别的抗原表位。
4. 免疫层析试纸条制备技术：将兔多克隆抗体（pAb）偶联蓝色乳胶微球制备免疫探针，以 mAb 2A5 为检测线，山羊抗兔 IgG 为对照线，组装免疫层析试纸条，并对其性能进行评估。

研究结果如下：

1. p30 蛋白的表达与鉴定：成功表达并纯化了 p30 蛋白，其大小约为 35kDa。Western blot 分析表明，纯化的 p30 蛋白能与 His-tag 单克隆抗体、ASFV 阳性血清特异性反应，证明其具有良好的免疫原性。
2. 单克隆抗体的制备与鉴定：筛选获得了抗 p30 的单克隆抗体 2A5，其重链为 IgG₁型，轻链为 κ 型。SDS-PAGE 和 Western blot 结果显示，mAb 2A5 纯度高、特异性好，抗体效价为 1:1.024×10⁶ 。
3. 抗原表位的鉴定：通过对 p30 蛋白进行多轮截短表达和检测，确定 mAb 2A5 识别的抗原表位为 58VKYDIVKSARIYAGQGY74。对该抗原表位的序列分析发现，其与中国流行毒株具有较高的保守性。
4. 免疫层析试纸条的性能评估：优化了免疫层析试纸条的制备条件，确定了最佳参数。该试纸条的最低检测限为 10ng/mL，对 p30 蛋白具有良好的检测灵敏度。同时，试纸条与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒 2 型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）等无交叉反应，特异性良好。在 37℃储存 100 天后，试纸条仍能区分阳性和阴性样本，稳定性良好。
5. 临床样本检测：使用免疫层析试纸条和 qPCR 试剂盒对 333 份临床样本进行检测，结果显示试纸条对不同类型样本的检测性能有所差异，对全血和血清样本的检测效果较好。两种方法的检测结果一致性达到 92.2%，表明免疫层析试纸条具有良好的临床应用前景。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功制备了抗 p30 的单克隆抗体 2A5，并鉴定了其识别的抗原表位。基于此，建立了一种检测 ASFV 抗原的蓝色乳胶微球免疫层析试纸条方法。该方法操作简便、检测快速、成本效益高，适合现场检测。与传统的胶体金标记材料相比，蓝色乳胶微球具有更好的稳定性。不过，该方法也存在一定的局限性，未来可通过进一步筛选单克隆抗体来提高其灵敏度，同时优化试纸条的样本垫，使其更适合全血样本的检测。总体而言，这项研究为非洲猪瘟病毒的现场检测提供了新的选择，在非洲猪瘟的防控中具有重要的应用价值，有望为养猪业的健康发展保驾护航。