综述：无细胞 DNA 作为生物标志物的潜力：神经退行性疾病的机遇与挑战

无细胞 DNA（cfDNA）或可成为神经退行性疾病诊断新希望，本文为你详解其研究进展与挑战。

　　

一、引言

在生命科学和健康医学领域，生物标志物对于疾病的诊断、预后评估和治疗指导意义重大。无细胞 DNA（cell-free DNA，cfDNA）作为一种极具潜力的新型生物标志物，近年来受到广泛关注。cfDNA 是指细胞通过凋亡、坏死或主动分泌等方式释放到体液中的双链短片段 DNA，其长度通常在 80 - 200bp 之间。自 1948 年在人类血浆中首次被发现以来，随着研究的不断深入，cfDNA 在多种疾病中的诊断和监测价值逐渐凸显，尤其是在神经退行性疾病领域，为攻克这类复杂疾病带来了新的希望。

二、cfDNA 释放与清除机制

1. 释放机制
   • 凋亡（Apoptosis）：细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是 cfDNA 释放的重要途径。在生理和病理刺激下，细胞内一系列分子事件被触发，其中半胱天冬酶（Caspases）发挥关键作用。Caspases 激活半胱天冬酶激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated DNase，CAD），CAD 将染色体 DNA 切割成 160 - 180bp 的核小体片段，使 cfDNA 呈现出凝胶电泳可见的梯状条带。若细胞缺乏功能性的半胱天冬酶，吞噬细胞及其相关核酸酶会参与凋亡细胞 DNA 的降解。凋亡细胞的高效清除机制可防止炎症和自身免疫反应，但清除障碍会导致 cfDNA 水平升高。
   • 坏死（Necrosis）：坏死是细胞受到严重外部损伤后的意外死亡形式。在坏死过程中，细胞经历核染色质聚集、细胞器和细胞肿胀、质膜崩解等阶段，最终释放出细胞内容物，包括高分子量的 DNA 片段，长度可达 10,000 碱基对左右。坏死释放的 cfDNA 常见于创伤、损伤和败血症等情况，且其水平与病情严重程度相关。由于坏死细胞清除较慢，这些较大的 DNA 片段在血液中存在时间较长，易引发炎症反应。
   • 主动分泌（Active Secretion）：cfDNA 的主动分泌是一个受调控的过程，与细胞间通讯、信号传导等功能相关。研究发现，培养细胞中 cfDNA 的释放与细胞凋亡或坏死水平无关，而与处于 G1 期的细胞比例有关。cfDNA 可能通过外泌体等细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）主动分泌到细胞外，外泌体可保护 cfDNA 不被降解，提高其在血液中的稳定性。
2. 清除机制在健康个体中，cfDNA 水平较低，这得益于体内高效的清除机制。核酸酶在 cfDNA 的快速降解中起重要作用，随后脾脏、肝脏和肾脏等器官参与清除降解产物。cfDNA 的结合状态，如是否与蛋白质、核小体或抗体结合，以及是否被包裹在膜结合颗粒（如凋亡小体和外泌体）中，都会影响核酸酶的清除效率。快速清除 cfDNA 对于维持体内平衡、防止炎症和自身免疫反应至关重要。

三、液体活检与 cfDNA 的重要性

1. 液体活检优势组织活检一直被视为生物标志物检测的金标准，但在临床应用中存在诸多局限性，如组织样本量不足导致 DNA 提取困难、样本保存不当引起 DNA 降解或损伤、采样过程存在风险以及患者接受度低等。近年来，液体活检技术逐渐兴起，它通过采集血浆、血清、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）、尿液、唾液和胸腔积液等体液，分析其中的分子成分，包括 cfDNA、无细胞 RNA（cell-free RNA，cfRNA）、循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）和 EVs 等。液体活检具有无创、成本效益高、安全且可重复采样等优点，能够提供更全面的疾病信息，尤其适用于组织采样困难的情况，如脑部和脊髓疾病的诊断和监测。
2. cfDNA 在液体活检中的挑战与潜力尽管液体活检优势明显，但 cfDNA 在临床应用中仍面临挑战。由于血脑屏障（blood - brain barrier，BBB）的存在，源自中枢神经系统（central nervous system，CNS）的 cfDNA 在血浆中的浓度极低，这给检测带来了困难。此外，cfDNA 水平易受多种因素影响，个体差异较大，需要更精准的测量和检测方法。不过，cfDNA 能够反映遗传和表观遗传改变，在神经退行性疾病的早期检测和治疗监测方面具有巨大潜力，有望成为传统诊断方法的重要补充。

四、cfDNA 的分离与检测方法

1. 样本采集cfDNA 检测的准确性高度依赖样本采集和保存的质量。样本采集过程中的诸多因素，如采集管类型、预离心延迟时间和条件、处理和储存温度、离心方案和速度、血浆储存时间以及冻融循环次数等，都会影响 cfDNA 的产量、完整性、基因组 DNA 污染程度和检测结果的可靠性。常用的血液采集管有抗凝剂涂层管，如乙二胺四乙酸（EDTA）管、肝素管和柠檬酸盐管，其中 EDTA 管应用最为广泛。对于需在采集后 4 - 6 小时内处理且室温保存的样本，EDTA 管即可满足需求；若处理延迟（≥6 小时），则推荐使用专门的血液采集管，如 Streck Cell-Free DNA BCT 和 PAXgene Blood cfDNA Tubes，这些管中含有细胞稳定剂，可保护 cfDNA、减少基因组 DNA 污染。脑脊液是神经元来源核酸的丰富来源，对疾病特异性 cfDNA 分析具有更高的敏感性，但采集过程相对侵入性较强，通常需要进行腰椎穿刺。为保证血浆样本质量，推荐采用两步离心法，即先低速离心（800 - 2000×g），再高速离心（14,000 - 16,000×g），以去除细胞碎片和减少基因组 DNA 污染。若不能立即进行 cfDNA 分离，应将样本短期储存于 - 20°C（不超过 48 小时）或长期储存于 - 80°C，并避免反复冻融。
2. 分离方法由于 cfDNA 在生物体液中浓度极低且易受污染，高效的分离技术至关重要。目前常用的 cfDNA 提取方法包括柱式法、磁珠法、酚 - 氯仿法和商业自旋柱试剂盒等。磁珠法能够高效捕获低浓度样本中的碎片化 DNA，性能稳定，但成本较高；自旋柱试剂盒操作简单、产量高、可有效去除污染物，在科研和临床诊断中应用广泛，不过其成本相对较高；酚 - 氯仿法虽然有效，但操作繁琐、易污染，且有机溶剂可能干扰下游应用。此外，微流控技术和液相 DNA 分离方法等新兴技术也在不断发展，有望实现更高效、灵敏的 cfDNA 分离，但目前仍处于实验阶段。
3. 检测方法cfDNA 的检测方法主要有定量聚合酶链反应（quantitative PCR，qPCR）、数字聚合酶链反应（digital PCR，dPCR）和下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术等。qPCR 通过荧光标记与 DNA 结合，根据荧光强度对特定 DNA 序列进行实时定量，操作简便、成本效益高，适用于检测已知突变基因，但在检测罕见突变或多靶点时存在局限性。dPCR 通过将样本分成大量单个反应进行扩增，实现绝对定量，具有更高的灵敏度、精度和可重复性，尤其适用于分析低浓度 cfDNA 样本和检测低丰度突变，但只能检测已知突变，且设备和操作要求较高。NGS 技术可对大量 DNA 片段进行平行测序，能够检测多种遗传改变，提供全面的遗传信息，在监测治疗反应和发现耐药机制方面具有优势，但成本高、检测周期长，需要专业的生物信息学分析。在实际应用中，应根据具体需求选择合适的检测方法，也可将多种方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。

五、cfDNA 作为神经退行性疾病生物标志物的新兴作用

1. 神经退行性疾病诊断现状与挑战神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）等，是一类以神经元进行性退化为特征的疾病，其发病率随年龄增长而显著增加。这些疾病通常进展缓慢，早期症状不明显，缺乏可靠的生物标志物，导致诊断困难。传统的诊断方法，如影像学检查和组织活检，存在一定的局限性，如影像学检查对早期病变的敏感性较低，组织活检具有侵入性且不适用于所有患者。因此，开发非侵入性、准确可靠的诊断工具迫在眉睫。
2. cfDNA 在神经退行性疾病中的应用潜力
   • 反映疾病动态变化：cfDNA 的半衰期较短（约 2 小时），能够及时反映疾病相关病理状态的动态变化，可作为实时生物标志物监测疾病活动和神经元损伤情况，为评估治疗效果提供重要依据。例如，在 AD 和 PD 患者中，cfDNA 水平的变化可反映疾病的进展和对治疗的反应。
   • 揭示遗传和表观遗传信息：cfDNA 不仅能反映遗传突变，还能提供表观遗传信息，如 DNA 甲基化模式。DNA 甲基化异常与多种神经退行性疾病密切相关，通过分析 cfDNA 的甲基化状态，可辅助疾病诊断和了解疾病发生发展机制。例如，在 AD 患者中，特定基因的 DNA 甲基化变化可作为潜在的生物标志物；在 ALS 患者中，研究发现了与疾病相关的独特甲基化特征。
   • 区分疾病亚型：cfDNA 的片段化模式和线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的变化有助于区分神经退行性疾病的不同亚型。例如，通过分析 cf-mtDNA 的拷贝数和缺失比例，可鉴别特发性帕金森病（idiopathic Parkinson’s disease，iPD）和 LRRK2 相关帕金森病（LRRK2-PD）；在 ALS 患者中，cf-mtDNA 水平与疾病进展相关，且特定基因突变可在 cfDNA 中检测到，有助于区分家族性和散发性 ALS。
3. cfDNA 在常见神经退行性疾病中的研究进展
   • 阿尔茨海默病（AD）：AD 是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征为淀粉样 β 蛋白斑块和 tau 蛋白缠结的积累，导致神经元死亡和认知功能下降。研究发现，AD 患者血浆中的 cfDNA 水平显著升高，且与神经元损伤程度相关。此外，AD 患者大脑组织中的 DNA 甲基化变化可在血浆 cfDNA 中检测到，如 CYP51A1、CYP2S1、PRLHR 等基因的甲基化改变，以及 mtDNA 的低甲基化等，这些变化有望成为 AD 诊断和疾病监测的生物标志物。同时，检测 cfDNA 中的 APOE ε4 等位基因，可作为评估 AD 遗传风险的非侵入性方法。
   • 帕金森病（PD）：PD 主要与 α - 突触核蛋白的积累和黑质多巴胺能神经元的过度丧失有关，导致运动症状和非运动症状。对 PD 患者脑脊液和血清中 cfDNA 和 cf-mtDNA 水平的研究发现，患者血清中 cf-mtDNA 和总 cfDNA 水平显著升高，但 cf-nDNA 水平在调整年龄因素后差异消失。此外，脑脊液中 cf-mtDNA 水平在不同研究中存在差异，提示可能存在体内不同部位 cfDNA 动态变化的差异。通过分析 cf-mtDNA 的拷贝数和缺失比例，可区分 iPD 和 LRRK2-PD，为疾病的精准诊断提供依据。
   • 肌萎缩侧索硬化症（ALS）：ALS 是一种进行性神经退行性疾病，主要表现为运动神经元丧失，导致肌肉无力、瘫痪和呼吸衰竭。线粒体功能障碍在 ALS 发病机制中起重要作用，患者循环中 cf-mtDNA 水平升高，且与疾病进展相关，特别是在携带 SOD1 突变的患者中。此外，ALS 相关基因突变（如 C9orf72、SOD1 和 TARDBP）可在 cfDNA 中检测到，有助于区分家族性和散发性 ALS。通过全基因组 DNA 甲基化分析，发现了与 ALS 相关的独特甲基化特征，为开发新的诊断方法提供了方向。
   • 多发性硬化症（MS）：MS 是一种慢性自身免疫性神经退行性疾病，免疫系统攻击神经纤维的保护鞘，导致神经功能障碍。研究表明，MS 患者血浆中 cfDNA 浓度显著高于健康人，分析循环 cfDNA 的甲基化状态有助于开发 MS 的分子标志物。此外，线粒体功能障碍与 MS 密切相关，血浆中 cf-mtDNA 水平在不同类型的 MS 患者中存在差异，且与炎症细胞因子水平相关，提示 cf-mtDNA 和细胞因子在 MS 的炎症反应和疾病进展中起重要作用。

六、挑战与优先建议

1. 面临的挑战
   • 技术难题：cfDNA 在临床应用中面临诸多技术挑战，如半衰期短，导致样本采集和处理时间窗口狭窄；易受基因组 DNA 污染，影响检测结果的准确性；CNS 来源的 cfDNA 在血液中浓度极低，难以与其他细胞来源的 cfDNA 区分，增加了检测难度。此外，目前的检测技术虽然不断发展，但仍需进一步优化，以提高检测的灵敏度和特异性，满足临床精准诊断的需求。
   • 标准化问题：缺乏标准化的样本采集、处理和分析流程，导致不同研究和实验室之间的结果差异较大，难以进行比较和验证。这限制了 cfDNA 检测在临床实践中的广泛应用，也阻碍了其在神经退行性疾病诊断和治疗中的进一步发展。
   • 个体差异影响：cfDNA 水平受多种因素影响，如年龄、性别、药物使用、身体活动和饮食等，个体之间的差异较大。这些因素不仅影响 cfDNA 的浓度，还可能改变其甲基化模式和片段化特征，增加了数据分析的复杂性和结果解释的难度。
2. 优先建议
   • 制定标准化指南：建立国际统一的 cfDNA 处理和分析指南，规范样本采集、储存、处理和检测等各个环节，确保实验结果的一致性和可重复性。例如，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）已制定了癌症研究中 cfDNA 分析的血液样本采集、处理、储存和质量评估指南，神经退行性疾病领域也需要类似的标准。
   • 多模态检测策略：采用多模态或多分析物液体活检方法，将 cfDNA 与其他生物标志物（如蛋白质、RNA 等）或成像技术相结合，提高诊断的准确性和特异性。例如，将 cfDNA 分析与 tau 蛋白、淀粉样 β 蛋白检测相结合，可更全面地了解 AD 的病理过程；结合 PET 扫描等成像技术，可进一步明确疾病的定位和严重程度，为治疗方案的制定提供更精准的依据。
   • 人工智能与机器学习应用：将人工智能（artificial intelligence，AI）和机器学习（machine learning，ML）技术应用于 cfDNA 和其他生物标志物的分析，能够处理复杂的数据集，挖掘潜在的生物标志物与疾病状态之间的关系，提高早期诊断、疾病分型和疾病进展预测的准确性。AI - 驱动的临床决策支持系统（clinical decision support systems，CDSS）可辅助医生进行临床决策，推动个性化治疗策略的发展。
   • 线粒体 DNA 研究：鉴于线粒体功能障碍在神经退行性疾病中的重要作用，加强对 cf-mtDNA 作为生物标志物的研究。进一步明确不同疾病中线粒体亚型的特征，探索针对线粒体功能障碍的精准治疗策略，为神经退行性疾病的治疗开辟新途径。
   • 大规模验证研究：开展大规模、多中心的研究，在不同人群和疾病背景下验证 cfDNA 生物标志物的有效性和可靠性。确保 cfDNA 检测在不同种族、年龄、性别等人群中的准确性和适用性，推动其从实验室研究向临床实践的转化。同时，开发针对医护人员的决策支持工具和培训项目，提高他们对 cfDNA 检测结果的解读和应用能力。

七、结论

cfDNA 作为一种新兴的生物标志物，在神经退行性疾病的诊断和监测方面展现出巨大的潜力。通过反映神经元损伤、线粒体功能障碍和遗传表观遗传改变，cfDNA 为深入了解神经退行性疾病的病理过程提供了新的视角。尽管目前在技术、标准化和个体差异等方面面临挑战，但随着检测技术的不断进步、标准化指南的制定以及多学科交叉研究的深入，cfDNA 有望成为神经退行性疾病诊断和治疗的重要工具。大规模多中心临床试验的开展将进一步验证其临床价值，推动精准医学在神经退行性疾病领域的发展，为患者带来新的希望。