综述：动物闭环刺激方法与记忆巩固

本文系统回顾了动物闭环刺激对睡眠相关记忆巩固的影响，为未来研究提供方向。

　　### 睡眠与记忆巩固的关联
睡眠在记忆巩固过程中发挥着关键作用，这一观点已得到广泛认可。研究发现，在安静觉醒状态下，也会发生具有不同特性的记忆巩固，但睡眠对于记忆巩固的意义尤为重要。

从神经机制角度来看，记忆形成的神经两阶段模型与海马体中的尖波涟漪（SPWR，~150 - 200Hz）密切相关。SPWR 在非快速眼动（NREM）睡眠期间出现，它能够促使信息从海马体转移到新皮层。这种转移过程被认为是记忆从临时存储的海马体向长期存储的新皮层过渡的关键步骤。在 NREM 睡眠中，海马体的 SPWR 和丘脑皮质纺锤波（~12 - 15Hz）主要在睡眠慢振荡（SO，~1Hz）的特定阶段出现，这表明大脑区域之间存在时间依赖性的交流，这种交流对于信息在不同存储系统之间的传递至关重要。

正是由于大脑振荡及其时间耦合对记忆巩固具有潜在的重要性，科研人员开发了多种旨在促进相应脑节律及其耦合的干预方法。在人类研究中，这些非药物干预手段主要包括感觉、电和磁刺激，此外，光生物调节和超声等也作为潜在的新方法逐渐受到关注。而在动物实验中，光遗传学和化学遗传学技术被广泛应用，用于深入研究睡眠机制中强烈依赖时间的相关方面。

闭环刺激方法概述

闭环（cl）刺激是一种用于探究特定振荡阶段活动相关性的重要方法，它能够测试脑节律的时间耦合以及其功能相关性。在典型的闭环刺激实验中，当检测到自发的正在进行的脑电生理事件（如睡眠 SO）时，会触发刺激，这种刺激可以直接进行，也可以在时间或相位上与内源性神经事件存在一定的延迟。在人类研究中，除了一项近期的研究外，闭环刺激大多是通过非侵入性记录传感器和刺激靶点在睡眠中进行实验的。然而，要深入了解皮层下脑区对记忆巩固在时间上的精确贡献，侵入性电生理研究是必不可少的。因此，本文系统回顾的重点是啮齿动物研究，这些研究采用闭环刺激程序，同时监测特定的内源性脑电生理事件（而非持续的脑状态），以探究记忆形成过程。

研究方法

1. 文献检索：为了全面获取相关研究成果，研究人员在 PubMed 资源平台上，使用 “closed - loop stimulation sleep memory”“closed - loop stimulation sleep”“phase locked acoustic”“phase locked auditory”“event triggered sleep memory”“ripple triggered memory sleep” 和 “memory sleep optogenetic inhibition” 等关键词，并结合 “animal”“rat”“mouse”“ferret”“cat” 等动物相关词汇，通过 “AND” 运算符进行组合检索。最终检索到 585 篇相关文献。
2. 研究筛选：为确保研究的可靠性和相关性，制定了严格的纳入标准。具体包括：刺激方式必须为闭环刺激；刺激必须在睡眠期间进行；研究对象为非人类，主要集中在大鼠和小鼠；研究必须是基于样本群体的原创性研究论文；刺激程序的目标必须是记忆过程。同时，排除了综述文章和计算研究。
3. 数据提取：研究数据的提取工作由一名研究人员（TR）手动完成，使用预先定义的数据提取表进行操作。之后，由另一名研究人员（LM）对选定的文章进行审核。最终，所有数据被整理到一个 Excel 文件中，以便进行后续分析。
4. 偏倚评估：在将研究纳入最终分析之前，研究人员对所有文章进行了五项潜在偏倚的评估，包括选择偏倚（聚焦于组间或实验阶段的基线特征以及随机化情况）、表现偏倚、检测偏倚和损耗偏倚。每项研究的偏倚评估由两名研究人员共同完成，并使用在线工具将评估结果进行可视化展示。虽然部分研究存在一些偏倚问题，如部分研究未进行随机化、数据收集和分析未设盲等，但研究人员认为这些偏倚风险不足以排除任何一项研究。

研究结果

1. 声学刺激研究：在使用声学刺激的研究中，Aksamaz 等人对小鼠的睡眠 SO 四个阶段进行了闭环刺激，在检测到 SO Down 状态时，给予 10ms 的白噪声刺激。研究结果显示，与假刺激或 Down 状态刺激相比，Up 状态刺激能够显著提高小鼠在空间物体识别任务中的表现，具体表现为偏好指数的增加。同时，这种刺激还能增强刺激触发的 SO - 海马体 SPWR 耦合以及 delta 和 sigma 频段的活动。Moreira 等人则对大鼠的慢波进行了闭环刺激，在检测到 SO Up 状态或 Down 状态时，给予 30ms 的粉红噪声刺激。结果发现，Up 状态刺激能提高大鼠在获取食物颗粒任务中的成功率，并且增加 delta 和 sigma 频段的活动，以及它们与学习相关增量的相关性。此外，两项研究均未发现刺激和假刺激条件下 NREM 或 REM 睡眠时间存在显著差异，但 Aksamaz 等人的研究观察到，与 Up - to - Down 状态刺激相比，Up 状态刺激会显著增加 PreREM 睡眠的持续时间，而 PreREM 睡眠中的纺锤波可能是行为的良好预测指标。
2. 光遗传学刺激研究：三项采用光遗传学刺激的研究中，Latchoumane 等人在检测到额叶 EEG SO Up 状态时，以固定的纺锤体频率范围（16Hz）对小鼠丘脑网状核（TRN）进行光遗传学刺激。结果表明，与假刺激和异相刺激相比，同相刺激能够显著增强小鼠在情境恐惧条件反射（CFF）和物体位置识别（OPR）任务中的表现，同时增加诱导的纺锤体振荡与额叶 EEG SO 和海马体局部场电位（LFP）SPWR 的共发生率。Gulati 等人在睡眠 / 休息期间，对大鼠初级运动皮层（M1）进行 SO Up 状态的光遗传学抑制。结果发现，这种抑制会导致大鼠在神经假体学习任务中的表现显著下降，同时降低目标神经元的平均调制深度和尖峰频率相干性。Kim 等人进一步研究了不同脑电波状态下的光遗传学抑制对大鼠学习性能的影响。他们发现，抑制训练后睡眠中的 SO 和 SO/delta Up 状态会显著降低睡眠后的学习性能，而仅抑制 delta Up 状态则会提高学习性能。在神经层面，Up 状态抑制会抑制纺锤体与 SO 的嵌套，而 delta - 纺锤体嵌套的抑制与性能改善相关。
3. 电刺激研究：四项针对大鼠的电刺激研究中，Girardeau 等人通过对腹侧海马联合区进行电刺激，中断海马体的 SPWR 和尖峰活动，结果发现这种刺激会显著损害大鼠的学习性能。Maingret 等人在检测到涟漪活动时，通过短暂的颅内电脉冲诱导新皮层区域产生 delta 波和纺锤体活动，结果表明，只有与 SPWR 耦合的刺激才能促进慢波和 SPWR 活动的耦合，并且这种刺激能够提高大鼠在空间记忆任务中的回忆性能。Sierra 等人对内侧前脑束（MFB）进行电刺激，发现这种刺激能够促进恐惧条件反射动物的消退学习行为，减少冻结行为。Novitskaya 等人对蓝斑（LC）进行高频闭环涟漪触发刺激，结果发现这种刺激会抑制涟漪和纺锤体活动，降低大鼠在径向臂迷宫中的参考记忆。

闭环刺激技术细节

在已开展的研究中，不同研究采用了多样化的闭环刺激技术手段。Aksamaz 和 Latchoumane 等人基于 Ngo 团队的阈值法检测 SO。具体而言，先通过带通或低通滤波分离出感兴趣频段，再依据振幅阈值检测 SO，并且在记录过程中持续更新阈值以应对峰值振幅波动。Latchoumane 的系统在生成纺锤序列前会延迟 90 毫秒，Aksamaz 则借助可编程现场可编程门阵列（FPGA），在检测到 SO Down 状态峰值 2 毫秒后就能实施声学刺激。

Moreira 等人运用极窄的 SO 带通滤波器，通过识别信号的正向过零点来确定 SO 相位，利用数字信号处理器（DSP）实现实时处理。Gulati 和 Kim 等人利用 TDT 系统监测睡眠中的 SO，Gulati 采用 “基于功率” 和 “基于滤波” 两种触发方式，经对比发现二者结果相近。Kim 则依据神经放电与 LFP 的关系来区分 SO LFP 相位。

在 SPWR 的在线检测和闭环刺激方面，Girardeau 和 Maingret 等人借助 CED 系统，通过带通滤波、平方、归一化后设定阈值触发刺激。Novitskaya 同样采用阈值法，不过是基于 140 - ~240Hz 带通滤波的 CA1 LFP 信号。Sierra 运用 TDT 系统，对 150 - 250Hz 带通滤波的 LFP 涟漪活动进行均方根计算，以此检测海马体 SPWR。总体来看，FPGA 和 DSP 在闭环刺激的实时滤波和检测算法中应用广泛，部分研究在检测 SO 时还着重开发了在线 NREM 睡眠检测算法。

研究结论与展望

综合这些研究成果，动物闭环刺激实验通过选择性地调控睡眠中的关键事件，有力地证实了区域间神经耦合在记忆巩固进程中的重要作用。不过，研究中也呈现出一些特异性现象。例如，刺激 TRN 会影响 SPWR 与额叶 SO 的共发生，却对顶叶 SO 无此作用；而且，纺锤体在 SO 和 delta 波中的嵌套特性存在差异。这就引出了新的问题，即 SPWR 在嵌套于 SO 和 delta 波的纺锤体中的发生时间是否有别，或者不同程度的神经化学调节活动是否会造成功能差异。

一般来说，无论采用何种刺激方式，诱导产生的活动与内源性节律活动都可能存在差异。这种差异是否能够揭示神经网络未知的神经可塑性，进而为未来的转化研究提供方向，值得深入探讨。目前，多数闭环刺激检测方案仍依赖视觉判断来设定阈值，研究人员建议考虑运用机器学习算法优化阈值设定，助力该领域向精准应用迈进。

此外，已报道的研究均以雄性动物为研究对象。尽管纳入雌性动物会增加研究成本和时间，但为确保研究成果的普适性，考虑性别差异至关重要，因为已有研究表明在睡眠和记忆巩固方面可能存在性别依赖性效应。