水稻中 ac4C 修饰的关键调控因子 OsNAT10：影响光合作用与作物生长的新发现

本文揭示了水稻中 OsNAT10 作为 ac4C 乙酰转移酶，调控光合作用和植物发育，为作物改良提供新方向。

　　### 引言
N⁴- 乙酰胞苷（ac⁴C）最初在细菌 tRNAs 中被发现，对确保蛋白质合成过程中的解码准确性至关重要。在真核生物中，ac⁴C 也存在于 tRNAs 和 18S rRNA 中，对 tRNA 和核糖体的生物发生起着重要作用。近年来，ac⁴C 作为一种新的 mRNA 修饰在古细菌和人类中被鉴定出来。在人类中，N - 乙酰转移酶 10（NAT10）催化 ac⁴C 的形成，其对 mRNA 稳定性和翻译效率有重要影响，且在细胞周期调控、胚胎干细胞分化等过程中发挥关键作用。

在植物领域，拟南芥中已鉴定出两个 hNAT10 的同源物，它们通过影响叶片发育相关基因的稳定性来调控叶片发育。水稻中也存在 ac⁴C 修饰，但其生物学功能和调控机制在很大程度上仍不清楚。

光合作用对地球上的生命至关重要，受到多种因素的调控。转录因子在转录水平上对光合作用调控起着关键作用，例如 Golden 2-like（GLK）基因影响拟南芥叶绿体发育进而调控光合作用；COGWHEEL1（COG1）通过直接结合光捕获复合体（LHC）基因的启动子来增强其表达。在翻译后水平，磷酸化参与光合适应和状态转换，如 STN7 对 LHCII 蛋白的磷酸化，以及 Wheat Kinase START1（WKS1）对 PsbO 的磷酸化。此外，组蛋白修饰和 RNA 修饰（如 N⁶- 甲基腺嘌呤（m⁶A））也参与光合作用的调控。然而，正常条件下 RNA 修饰对水稻光合作用的调控机制仍不明确。

研究人员此前已鉴定出 OsNAT10 是水稻中 hNAT10 的同源物，本研究深入探讨了 OsNAT10 在水稻中的功能，发现它在水稻发育和光合作用调控中起着关键作用。

实验材料与方法

研究以水稻（Oryza sativa）为实验材料，包括日本晴（Nipponbare）、Kitaake、ZH11 以及 osnat10 突变体等。实验在生长室和田间进行，生长室条件为短日（10 h 光 / 14 h 暗），温度 28°C ± 2°C，光照强度 800 mmol m^?2 s^?1 ；田间实验分别在湖南杂交水稻研究中心和海南陵水的实验田进行。

通过构建多种质粒，如 35S:OsNAT10-GFP、35S:OsLIR1-GFP 等，利用农杆菌介导的转化方法获得转基因水稻植株。

采用多种实验技术，如测量光合参数（包括细胞间 CO₂分压、气孔导度、蒸腾速率和最大光合速率等）、分离 mRNA、进行 RNA 斑点印迹、GUS 染色、重组蛋白表达与纯化、体外酶促反应、免疫沉淀 ac⁴C RNAs 和 qRT-PCR、构建 mRNA 和 acRIP-seq 文库、进行放线菌素 D 处理、5-EU 处理和分离 5-EU 标记的 RNA、核糖体分析、核糖体新生链复合体（RNC）提取、原生质体分离和转染、RNA 免疫沉淀测定等，对相关指标进行检测和分析。

利用多种软件和算法，如 ImageJ、DAVID web server、AdapterRemoval、STAR、DESeq2、DEGseq、MeRIPtools 等进行数据分析。通过双尾 Student's t 检验和 Kolmogorov-Smirnov 检验等统计方法，评估数据的显著性。

实验结果

1. osnat10 突变体表现出多种发育缺陷：研究通过基因组编辑获得了两个 osnat10 突变体 osnat10-1 和 osnat10-2，与野生型相比，突变体的 ac⁴C 修饰水平降低，幼苗更短。在幼苗期，突变体的胚根长度较短，冠根和侧根数量显著减少；在分蘖期，根长也较短；在成熟期，植株高度显著降低，分蘖数减少，第一、二、三 internodes 和穗长均显著缩短，单株产量降低。将 OsNAT10 在 osnat10-1 中过表达后，这些发育缺陷得到完全挽救，表明 OsNAT10 对水稻的正常发育至关重要。
2. OsNAT10 在活跃增殖组织中显著表达：利用 OsNAT10 的启动子驱动 GUS 表达，构建了 OsNAT10pro:GUS 报告株系。GUS 信号在 2 天和 4 天幼苗的地上部分和根中均有检测到，在 12 天幼苗的幼叶、根尖和侧根起始位点等活跃增殖组织中信号尤其强烈。实时 qPCR 分析显示，OsNAT10 在各种组织中均有表达，在小穗中表达水平最高。然而，RNA 斑点印迹和液相色谱串联质谱分析表明，ac⁴C 修饰在茎和叶鞘中最为丰富，这表明 ac⁴C 的调控机制较为复杂。

通过在烟草表皮细胞和水稻原生质体中瞬时表达 35S:OsNAT10-GFP，发现 OsNAT10 蛋白定位于细胞核。值得注意的是，OsNAT10 在细胞核中的均匀分布与拟南芥同源物在核仁中的强检测信号不同，这暗示了拟南芥和水稻在 ac⁴C 修饰机制上可能存在差异。
3. OsNAT10 是水稻 ac⁴C 乙酰转移酶：由于 OsNAT10 在 ac⁴C 修饰中起着关键作用，研究人员对其是否为 ac⁴C 乙酰转移酶进行了研究。由于全长 OsNAT10 蛋白太大难以在大肠杆菌中表达，研究人员纯化了其通用控制非抑制 5（GCN5）相关的 N - 乙酰转移酶（GNAT）结构域。体外实验表明，与对照 MBP-His-GFP 相比，MBP-His-GNAT 能有效催化 osnat10-1 RNA 的 ac⁴C 修饰。此外，在 osnat10-1 中过表达 OsNAT10 可使 mRNA 的 ac⁴C 水平恢复到略高于野生型的水平，证实了 OsNAT10 是参与水稻 mRNA ac⁴C 修饰的乙酰转移酶。

为了研究 OsNAT10 调控的 ac⁴C 修饰 mRNA 的全局分布，研究人员进行了乙酰化 RNA 免疫沉淀和测序（acRIP-seq）。结果显示，野生型和 osnat10-1 中分别检测到 7840 个和 3497 个 ac⁴C 富集峰，对应 4008 个和 2217 个基因，其中 1602 个基因在两者中均有 ac⁴C 修饰。在 osnat10-1 中，1147 个基因的 ac⁴C 修饰水平降低，2406 个基因在野生型中具有特异性 ac⁴C 修饰。这些基因富集在与翻译相关的基因本体（GO）术语中。

进一步分析发现，osnat10-1 中 ac⁴C 富集得分显著降低，ac⁴C 修饰在 3′ UTR 的百分比减少，在编码序列（CDS）的百分比增加。通过独立的 acRIP-qPCR 验证，发现 osnat10-1 中一些参与金属离子结合、信号转导等过程的基因，如 Silicon efflux transporter LSI3（OsLSI3）和 Zinc-finger homeodomain protein 5（OsZHD5）的 ac⁴C 修饰减少。此外，osnat10-1 和 osnat10-2 中 OsNAT10 蛋白的 RNA 结合能力减弱，表明突变影响了其 RNA 结合功能。
4. OsNAT10 功能缺失降低水稻光合速率：对 10 天龄的野生型和 osnat10-1 幼苗进行 RNA 测序（RNA-seq）分析，发现 osnat10-1 中有 225 个基因显著上调，433 个基因显著下调。显著下调的基因富集在 “磷酸化”“对刺激的响应” 等 GO 术语中，有趣的是，还富集在 “光合系统 I 中的光合电子传递”，这表明 OsNAT10 参与光合作用的调控。同时，在野生型中具有特异性 ac⁴C 修饰的基因也富集在 “光合作用” GO 术语中。

对 osnat10 突变体的光合特性进行检测，发现突变体的细胞间 CO₂分压（Ci）较高，气孔导度（g_s）和蒸腾速率（E）降低，最大光合速率（A_max）也低于野生型。此外，突变体的实际电子传递速率（ETR）和非光化学猝灭（NPQ）值也较低，这些结果表明 osnat10 突变体存在光合缺陷。
5. osnat10 中光合调控基因的 RNA 稳定性和翻译效率降低：研究人员此前发现 ac⁴C 与 RNA 稳定性呈正相关。在本研究中，RNA-seq 和 RT-qPCR 结果显示，osnat10-1 中 OsLSI3 和 OsZHD5 的表达下调。利用放线菌素 D 处理和 5 - 乙炔基尿苷（5-EU）脉冲标记实验表明，osnat10-1 中 OsLSI3 和 OsZHD5 的 RNA 稳定性降低，其半衰期显著缩短。通过对 RNA-seq 数据的分析进一步证实，野生型的相对 RNA 稳定性高于 osnat10-1，且这种差异与 ac⁴C 修饰的位置无关。

已知 LIGHT-INDUCED RICE1（LIR1）和 LEAF-TYPE FERREDOXIN-NADP⁺ OXIDOREDUCTASE（LFNR）相互作用调控水稻光合作用。研究发现，野生型中 OsLIR1 的 5′ UTR 存在 ac⁴C 修饰，而 osnat10-1 中不存在。acRIP-qPCR 结果证实了这一点，且 osnat10-1 和 osnat10-2 对 OsLIR1 的结合亲和力显著降低，OsLIR1 的表达水平也下降。同样，利用放线菌素 D 处理和 5-EU 脉冲标记实验表明，osnat10-1 中 OsLIR1 的 RNA 稳定性降低，半衰期从 14.4 h 缩短至 3.6 h。

此外，OsLFNR2 在 OsNAT10 依赖的方式下存在 ac⁴C 修饰，osnat10-1 和 osnat10-2 对 OsLFNR2 的结合减少，其表达水平也下降，且存在 ac⁴C 介导的 RNA 稳定性调控。

通过多聚核糖体分析发现，osnat10-1 中多聚核糖体相关 mRNA 的总量减少，表明 ac⁴C 对 mRNA 翻译有促进作用。利用核糖体新生链复合体测序（RNC-seq）数据发现，ac⁴C 修饰在 5′ UTR 和 CDS 的基因，其翻译效率下调更为明显。具体到 OsLIR1 和 OsLFNR2，osnat10-1 中多聚核糖体相关的 OsLIR1 mRNA 显著低于野生型，而 OsLFNR2 mRNA 水平与野生型相当。这些结果表明，osnat10 中光合调控基因 OsLIR1 的 RNA 稳定性和翻译效率均降低。
6. ac⁴C 调节 OsLIR1 的翻译效率：OsLIR1 在黑暗中积累，在野生型和 osnat10-1 中均观察到这一趋势，但 osnat10-1 中 OsLIR1 的蛋白水平降低。为了证实 ac⁴C 对 OsLIR1 翻译效率的调节作用，研究人员构建了 35S:OsLIR1^WT和 35S:OsLIR1^m质粒，其中 35S:OsLIR1^m是将 OsLIR1 中 ac⁴C 修饰位点的七个胞嘧啶突变为腺嘌呤。将这些质粒转化到野生型和 osnat10-1 的水稻原生质体中，通过 acRIP-qPCR 检测发现，osnat10-1 中 35S:OsLIR1^WT的 ac⁴C 修饰减少，35S:OsLIR1^m的 ac⁴C 修饰显著低于 35S:OsLIR1^WT，表明这七个胞嘧啶是 ac⁴C 修饰位点。

对 OsLIR1^WT和 OsLIR1^m的蛋白水平进行检测，发现尽管 35S:OsLIR1^WT和 35S:OsLIR1^m的转录水平相当，但 OsLIR1^m的蛋白水平低于 OsLIR1^WT，这表明 ac⁴C 修饰增强了 OsLIR1 的翻译。通过提取 RNC 并利用 qPCR 检测核糖体结合的转录本，进一步证实了 ac⁴C 修饰增强了 OsLIR1 的翻译效率。
7. 过表达 OsLIR1 部分挽救 osnat10 的发育缺陷：为了研究 OsLIR1 对 osnat10 发育缺陷的遗传贡献，在 osnat10-1 中过表达 OsLIR1。结果显示，在幼苗期，osnat10-1 中过表达 OsLIR1 部分恢复了植株高度和根长，增加了冠根和侧根的数量；在分蘖期，也部分挽救了植株高度和分蘖数。同时，过表达 OsLIR1 使 osnat10-1 的关键生理参数，如 Ci、g_s、E、A_max、ETR 和 NPQ 等，恢复到接近野生型的水平，叶绿素含量的降低也得到部分或完全挽救。这些结果表明，OsNAT10 在调控光合缺陷方面，在遗传上位于 OsLIR1 的上游。

讨论

本研究鉴定出水稻中的 OsNAT10 是一种新型的 ac⁴C 乙酰转移酶。osnat10 突变体中 ac⁴C 修饰显著减少，但仍有残留，可能是由于突变体并非完全失活，且水稻中可能存在其他未鉴定的 RNA 乙酰转移酶参与 ac⁴C 修饰。确定新的 ac⁴C “writers” 将有助于更深入地理解 ac⁴C 的功能。

研究为 ac⁴C 促进翻译效率提供了证据，多个基因在 osnat10 中翻译效率降低，表明 ac⁴C 在植物 mRNA 翻译调控中起重要作用。ac⁴C 对 RNA 稳定性和翻译效率的调控具有选择性，且 ac⁴C 修饰在 5′ UTR 和 CDS 对翻译效率的影响大于在 3′ UTR。这种调控可能依赖于 ac⁴C 阅读器蛋白。

OsLIR1 和 OsLFNR2 是 ac⁴C 修饰的靶基因，ac⁴C 对它们的调控方式不同，分别影响 RNA 稳定性和翻译效率。ac⁴C 修饰的基因在拟南芥和水稻中均富集在 “光合作用” 类别，表明 ac⁴C 在单子叶植物和双子叶植物中对光合作用的调控具有保守性。

研究局限性

本研究使用的 osnat10 突变体为弱等位基因，其中仍能检测到 ac⁴C 修饰，因此 RNA 乙酰化的作用未得到充分研究。此外，NAT10 还催化 tRNAs、rRNAs 和蛋白质的乙酰化，需要进一步研究将观察到的表型与其在植物中的多种功能联系起来。

虽然研究表明 ac⁴C 修饰对 OsLIR1 的 RNA 稳定性和翻译效率至关重要，但对其在调控 OsLIR1 和光合作用方面的研究还不够深入。分析不同光合效率水稻品种中 OsLIR1 的 5′ UTR 单倍型，结合对其原生 ac⁴C 修饰位点的基因编辑，将有助于进一步探究这一调控机制。同时，由于 OsLIR1 与 OsLFNR1 和 OsLFNR2 共同发挥作用，单纯增加 ac⁴C 修饰来提高 OsLIR1 的 RNA 稳定性和翻译效率，可能无法显著提高水稻的整体光合速率。

本研究揭示了 OsNAT10 在水稻 ac⁴C 修饰、光合作用和植物发育中的重要作用，为深入理解 RNA 修饰调控作物生长发育的机制提供了重要依据，也为作物改良提供了新的方向和潜在靶点。未来的研究将聚焦于进一步明确 ac⁴C 修饰的调控网络，以及开发基于 RNA 修饰的作物育种策略。