创新策略助力脂肪干细胞向成骨细胞高效分化，为骨再生疗法带来新希望

研究针对脂肪干细胞（ASCs）成骨分化难题，探索新策略，发现多种因素协同可促其分化，为骨再生疗法提供新思路。

　　

研究背景：骨再生治疗的困境与挑战

在骨骼修复与再生的医学领域，间充质干细胞（MSCs）一直备受关注。其中，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）因对骨形成过程的重要贡献，成为研究骨相关疗法的热门对象。然而，获取 BMSCs 往往需要进行侵入性较强的骨髓采集手术，这给患者带来了较大痛苦和风险。

随着研究的深入，脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs）逐渐进入人们的视野。它可以从人体皮下脂肪组织中通过微创活检获取，来源丰富且获取过程相对简单。但美中不足的是，大量研究表明 ASCs 的成骨潜力低于 BMSCs，如何让 ASCs 高效地分化为成骨细胞，成为了科研人员亟待攻克的难题。

为了解决这一问题，来自波兰的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Journal of Biological Engineering》上。

研究方法：多管齐下，探索成骨奥秘

研究人员为了探究 ASCs 高效成骨分化的策略，运用了多种关键技术方法。在细胞培养方面，他们培养了 ASC52telo 细胞和正常人类 ASCs，并将其接种在不同成分的聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（PLGA）基复合生物活性玻璃（SBG）材料上。实验中，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，检测细胞中各种成骨相关基因的表达水平，以此来评估细胞的成骨分化程度。通过蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，分析细胞内相关蛋白的磷酸化水平，从而探究信号通路的激活情况。利用茜素红染色（Alizarin Red S staining）对细胞外基质的矿化程度进行半定量评估，直观地了解细胞的成骨效果。

研究结果：创新策略显著促进 ASCs 成骨分化

1. SBG-PLGA 复合材料支持 rhBMP-2 介导的成骨：研究人员首先评估了不同成分的 SBG-PLGA 复合材料对 ASCs 成骨的支持作用。他们发现，在标准成骨培养基中培养 ASCs 时，虽然早期成骨转录因子和细胞因子的 mRNA 水平有所增加，但在较长时间的培养中，典型的骨相关标记物表达并未持续上升。进一步研究发现，这可能与 BMP-2 抑制剂 Noggin 的表达增加有关。而添加重组人骨形态发生蛋白 2（rhBMP-2）后，能降低 NOG 的 mRNA 表达，增加 BMP-2 和早期及晚期成骨标记物的 mRNA 表达，促进 ASCs 的成骨进展。
2. Phenamil 和 PD98059 增强成骨 mRNA 表达：为了进一步增强 rhBMP-2 介导的成骨作用，研究人员在培养基中添加了 MEK1/2 激酶抑制剂 PD98059 和间接 Smurf1 抑制剂 Phenamil。结果显示，与单独添加 rhBMP-2 相比，联合使用这两种抑制剂能显著提高 BMP-2、骨钙素（OC）、骨桥蛋白（ON）和骨保护素（OPG）等成骨标记物的 mRNA 水平。通过优化各成分的剂量，确定了 100 ng/ml rhBMP-2、50 μM PD98059 和 20 μM Phenamil 的组合为最有效促进 ASCs 成骨反应的剂量。
3. 流体剪切应力促进成骨标记物表达：研究人员引入流体剪切应力，通过水平摇床对细胞进行处理。结果发现，在标准成骨培养基中，流体剪切应力能增加碱性磷酸酶（ALP）和 I 型胶原蛋白（COL1A1）的 mRNA 水平。当与 rhBMP-2、PD98059 和 Phenamil 联合使用时，能进一步增加 OC 和 OPN 的 mRNA 水平，且观察到细胞的 F - 肌动蛋白细胞骨架发生变化，细胞形状增大。同时，流体剪切应力还能增加 p-SMAD1/5/8 的水平，表明其增强了成骨信号通路的激活。
4. ZnO 或 SrO 修饰的 SBGs 强化成骨效果：考虑到锌（Zn）和锶（Sr）离子对成骨的积极影响，研究人员对 SBGs 进行了 ZnO 或 SrO 修饰。实验结果表明，在 3 天的静态培养中，修饰后的复合材料与 rhBMP-2、PD98059 和 Phenamil 联合处理，能显著提高 OPG 和 OC 的 mRNA 水平，且流体流动进一步增强了这种效果。在 7 天的培养中，先使用 rhBMP-2 预处理，再进行联合处理和流体流动，能显著提高更多细胞的 OPG 和 OC mRNA 水平。延长培养至 18 天，发现含 ZnO 修饰的 SBG 的复合材料能使细胞表达更高水平的 OPG 和 COL1A1。通过 7 天预培养后转移到普通培养板的实验，证实了这种培养方案能使 ASCs 产生高度矿化的细胞外基质。
5. 信号通路分析揭示潜在机制：研究人员还对成骨过程中的信号通路进行了分析。他们发现，PD98059 和 Phenamil 能增加 β -catenin 在 Ser552 位点的磷酸化水平，促进其转录活性，流体剪切应力进一步增强了这种作用。在 ZnO-S2-PLGA 培养的 ASCs 中，观察到环氧化酶 - 2（COX-2）表达增加，且流体剪切应力能增加 CREB 的磷酸化水平。这些结果表明，ZnO 和 SrO 修饰的 SBGs 可能通过激活 β -catenin、CREB 和 COX-2 等信号通路，协同促进 ASCs 的成骨分化。

研究结论与意义：开辟骨再生治疗新方向

本研究成功开发了一种创新、快速且有效的策略，能将人类 ASCs 分化为成骨细胞。该策略的关键在于使用含有 ZnO 或 SrO 修饰的 SBGs 的 PLGA 基生物活性复合表面、添加 rhBMP-2、Phenamil 和 PD98059 的成骨培养基，以及通过水平摇床引入的培养基流动。研究结果表明，这些因素协同作用，能显著促进 ASCs 的成骨分化，在短时间内实现细胞外基质的高度矿化。

从研究意义来看，这一成果为骨再生疗法带来了新的希望。在未来的临床应用中，该方法可用于快速将 ASCs 体外分化为早期成骨细胞或矿化成骨细胞，为创伤性骨缺损、骨折不愈合、骨愈合不良或生长障碍等疾病的治疗提供了新的选择。尽管还需要进一步研究评估该方法在体内的疗效，包括细胞的植入和维持成骨特性等方面，但无疑为骨再生领域的发展开辟了新的方向，具有重要的科学价值和临床应用潜力。