高分辨率 3D ECM 映射技术揭示肺部疾病的细胞外基质重塑特征

丹麦研究人员运用 3D ECM 映射技术和机器学习工具研究肺部疾病，发现纤维化是疾病特异性改变，助力肺病诊断。

　　细胞的功能依赖于细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的三维完整性。ECM 成分的位置和相互作用所形成的结构是细胞行为的核心调节因素，但由于缺乏针对基质的特异性分析，这一结构尚未得到明确解析。在此，研究人员运用一种高分辨率的 3D ECM 映射方法，并设计了一套由机器学习驱动的流程，以检测和描述健康及疾病状态下的 ECM 结构。

研究人员将这些工具应用于人体肺部，肺是一个高度依赖 ECM 结构的器官，且会受到多种不同组织病理学疾病的影响。他们分析了来自健康人、肺气肿患者、寻常型间质性肺炎（Usual Interstitial Pneumonia，UIP）患者、结节病患者和新冠肺炎（Coronavirus disease 19，COVID-19）患者的肺组织切片，生成了每种疾病的重塑特征，并绘制了健康 / 疾病概率图，进而推断出健康和患病 ECM 的结构。研究方法表明，过度的基质沉积，即纤维化，并非单一现象，而是一系列疾病特异性的改变。

细胞外基质（ECM）是最重要的生物材料，它塑造并支撑着所有组织，同时调节着所有细胞。ECM 结构复杂却又精确，每个器官在不同阶段都有特定的 ECM 结构。在疾病状态下，组织会发生结构变化，通过对细胞的异常调节加速并延续疾病进程。健康和患病的 ECM 结构在生物医学领域都具有重要意义，但令人惊讶的是，此前它们并未得到详细的绘制。此次研究结合组织工程与机器学习方法，揭示、绘制并分析了 ECM 结构，并将其应用于每年导致数百万人死亡的肺部疾病研究中。该方法能够为肺部疾病的诊断带来客观性和更高的可信度，此外，明确诊断所需的组织量可能远小于传统手动显微镜评估所需的量。

人类肺部的生物力学依赖于其 ECM 的空间连贯性和完整性。细胞构建并存在于 ECM 中，ECM 是一种由蛋白质和聚糖构成的高度有序的结构，同时 ECM 也调节着细胞行为。ECM 完整性和连贯性的丧失会导致调节功能的丧失，进而引发功能缺失和疾病的持续发展。

人类 ECM 的结构在很大程度上尚未被探索。这是由于在空间上解析 ECM 成分存在技术困难，ECM 成分被细胞掩盖（影响免疫标记），且现有的组织处理技术可能会引入人为的蛋白质交联（例如在组织透明化过程中），这可能会改变 ECM 的拓扑结构。此外，还缺乏能够提取 ECM 组织特征的定量方法。

研究人员进一步展示了一种通过灌注脱细胞法从人肺中分离 ECM 的方法。这种方法不会在化学或空间上改变 ECM 的结构。ECM 支架具有高渗透性，能够增强免疫标记效果，使抗体能够更深入地渗透，从而实现对 ECM 结构的亚微米分辨率成像。研究人员设计了一种定量机器学习（Machine Learning，ML）工具，该工具能够对重复的基序进行分组，构建疾病特异性特征，总结重塑模式，并提供健康 / 疾病概率图，以指导对疾病诱导的 ECM 重塑的研究。相比之下，定性评估可能超出了人类识别和归纳 ECM 结构模式的能力。

研究人员将这些方法应用于健康人、肺气肿患者、寻常型间质性肺炎（UIP）患者、肺结节病患者和新冠肺炎危重症患者，旨在测试这些方法识别不同组织病理学疾病模式的能力。他们分析了 IV 型胶原蛋白、弹性蛋白和纤维状胶原蛋白，因为这些蛋白质在肺泡壁的形状、弹性回缩和组织硬度方面发挥着重要作用。在此开发的 ML 方法揭示了健康和疾病特异性模式，使研究人员能够定义 ECM 的完整性和连贯性，并确定疾病特异性的结构特征。

研究获得了丹麦首都地区科学伦理委员会（VEK）的批准，批准文号为 H-17,005,566，符合丹麦和欧洲的相关规定。所有参与者均已签署知情同意书。所有法律和伦理要求、数据、代码和实验流程，要么在补充方法部分进行了详细说明，要么可通过其中链接的公开数据库获取。

研究纳入了因气胸接受手术的患者（作为健康对照，n=6）、肺气肿患者（n=6）、寻常型间质性肺炎（UIP）患者（此处未给出具体人数）。

脱细胞、免疫染色和双光子共聚焦显微镜技术揭示了人肺 ECM 的 3D 结构。研究人员重点关注了 IV 型胶原蛋白（ColIV）、弹性蛋白和纤维状胶原蛋白（后者通过二次谐波产生（SHG）图像表示）的空间排列。ColIV 代表基底膜（Basement Membrane，BM），这是一种片状结构，为肺泡壁和血管壁中的细胞提供粘附底物；弹性蛋白确保肺的回缩；纤维状胶原蛋白……（原文未描述完纤维状胶原蛋白相关内容）

基于溶剂使固定组织光学性质均匀化的组织透明化技术取得了显著进展。将组织透明化与荧光标记结合可揭示细胞群体和血管分布情况。计算分析能够实现细胞检测并描述其分布模式。然而，固定和溶剂通常会改变器官的结构和大小，导致单细胞分辨率成像不足以……（原文未描述完成像不足的内容）

本研究得到了欧洲研究委员会（European Research Council，ERC）的资助（项目编号：ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN，资助人员包括 AEMG、OW、MR、RR、JTE）、丹麦癌症协会（项目编号：R204-A12454，资助人员为 RR）、德国癌症援助组织（German Cancer Aid Deutsche Krebshilfe，资助人员为 RR）、诺和诺德基金会的 Hallas M?ller 奖学金（资助人员为 JTE）、Ragnar Soderberg 基金会（项目编号：N91/15，资助人员为 CDM）、瑞典研究委员会（项目编号：2017 - 03389、2019 - 02355、2020 - 02088，资助人员为 CDM）、瑞典癌症协会（项目编号：CAN 2016/783 和 19 0632 Pj，资助人员为 CDM）以及由首都地区资助的 MAX IV 成像数据量化中心（QIM）的支持。

Monica J. Emerson：撰写 - 评审与编辑、撰写 - 初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、数据管理、概念构思；Oliver Willacy：方法学、调查；Chris D. Madsen：撰写 - 评审与编辑、可视化、方法学、数据管理；Raphael Reuten：撰写 - 评审与编辑、调查；Christian B. Br?chner：撰写 - 评审与编辑、验证、资源、数据管理；Thomas K. Lund：撰写 - 评审与编辑