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这篇综述聚焦纤维环（AF）体外模型，剖析现状、不足并提出优化标准，助力椎间盘疾病研究。
一、引言
在人体脊柱的健康稳态中，纤维环（Annulus Fibrosus，AF）成熟组织起着至关重要的作用。它主要由 I 型胶原蛋白（Col I）薄片构成，这些薄片占其干重的 50 - 70%，以高度有序的角状层结构排列，角度在 30° - 65° 之间，具体角度取决于组织的位置。各个薄片之间由富含蛋白聚糖（Proteoglycans，PG）、弹性纤维和细胞的非组织化层间组织分隔开，它们通过跨层桥接网络（Translamellar Bridging Network，TBLN）相连，TBLN 主要由弹性蛋白、原纤维蛋白、PGs 和 IV 型胶原蛋白组成。
当椎间盘（Intervertebral Disc，IVD）发生退变时，AF 的完整性会受到损害。这是多种因素共同作用的结果，包括机械力、炎症以及生化失衡。其中，生物力学的改变会引发 AF 组织内的炎症反应，进而影响细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的分解代谢，成为椎间盘退变发病机制的重要环节。在这一过程中，白细胞介素（Interleukin，IL） - 1β 和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF） - α 等细胞因子的表达显著增加，同时 IL - 2、IL - 4、IL - 10、IL - 12 和 IL - 17 等也参与其中。这些炎症介质的变化会削弱 AF 组织，促进感觉神经的生长和血管化，不仅会导致疼痛，严重时还会压迫坐骨神经，最终引发 AF 失效和椎间盘突出。然而，目前人们对这一复杂过程的理解还十分有限。
尽管体内模型（主要是啮齿动物模型）在研究 IVD 退变 / 突出方面有一定应用，但它们难以深入揭示 AF 失效的机制。因此，体外研究模型对于剖析 AF 失效背后的发病机制至关重要。
二、当前 AF 组织体外模型
在 IVD 研究领域，AF 组织长期以来受到忽视，研究重点大多集中在髓核（Nucleus Pulposus，NP）组织上。目前，仅有少数体外 3D 研究聚焦于理解 AF 的发病机制。
部分研究致力于模拟 AF 组织与 IVD 中其他组织（如 NP 和软骨终板，Cartilage Endplate，CEP）之间的相互作用。例如，Chong 等人构建了体外模型，使用 30° 取向的聚碳酸酯聚氨酯支架培养牛 AF 细胞，并与软骨构建体共培养，成功再现了 AF 与 CEP 的界面。Srivastava 等人则利用基于胶原蛋白的水凝胶研究了炎症刺激下 NP 与 AF 组织的界面，通过评估 ECM 成分、促炎介质和聚糖分析，表明该模型有助于解读 IVD 病理过程中的变化。
也有研究针对 AF 细胞受其他细胞类型影响展开。Hwang 等人建立微流控平台，研究炎症条件下人类 NP 和 AF 细胞与内皮细胞的相互作用，增进了对 IVD 疾病中血管化过程的理解。还有诸多研究使用藻酸盐、自组装 AF 细胞团块、琼脂糖凝胶等不同材料构建体外 AF 模型，从不同角度探究 AF 细胞在炎症、与其他细胞共培养等条件下的反应。
不过，现有研究模型存在不少局限性。健康人类细胞来源稀缺，研究条件与 IVD 体内微环境相似度不足，模型构建的架构往往缺乏天然组织中胶原纤维的有序排列，并且体外研究中还需考虑生物力学刺激以更好地模拟人体脊柱的机械负荷。
三、理想 AF 体外模型的关键要求
（一）生物材料组成
天然 AF 组织主要由 Col I、PGs 和其他 ECM 蛋白组成，其中 aggrecan 是 AF 细胞外基质中含量最丰富的 PG，它能与胶原纤维结合。不同的糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs），如硫酸软骨素和硫酸角质素，对维持 AF 组织的水分保留和抗压性至关重要，弹性蛋白则为组织提供弹性。因此，在选择 AF 研究模型的支架生物材料时，应优先考虑天然生物材料。
目前虽有部分 AF 研究模型使用 Col I 水凝胶，但尚未见将 AF 细胞外基质成分混合作为生物材料的报道。然而，类似的生物材料组合已在其他组织研究中应用，如肺和心脏瓣膜研究中使用的胶原 / 弹性蛋白水凝胶，以及皮肤和软骨缺损研究中使用的胶原和硫酸软骨素混合水凝胶。此外，脱细胞化技术为模拟天然组织成分提供了新途径，AF 组织经脱细胞化处理后，可保留其天然机械性能和 ECM 成分，用于细胞接种和增殖，在 AF 研究模型开发中具有很大潜力。
（二）架构
AF 组织具有独特的各向异性架构，由同心排列的胶原纤维组成，这些纤维在 AF 的薄片内基本平行排列。层间组织中的 PGs 和弹性蛋白形成了层间基质，对维持 AF 组织的稳态和承受拉伸应力至关重要。因此，在体外准确再现这一复杂架构对模拟 AF 组织至关重要。
当前部分研究采用静电纺丝、挤出等技术制备各向异性的 AF 模型。例如，Chong 等人利用静电纺丝技术制备了各向异性的聚碳酸酯聚氨酯构建体，Dewle 等人开发了对齐的聚己内酯支撑的电压实 Col I 贴片，这些模型在细胞增殖、对齐和 ECM 成分产生方面取得了一定成果。脱细胞化方法在复制 AF 组织架构方面也具有优势，McGuire 等人使用脱细胞化的心包组织制备了具有诱导角状层取向的三层支架，并通过在层间掺入透明质酸来模拟层间 GAG 层。然而，目前的各向异性策略在构建体组成上与天然 AF 组织仍存在差距，未来需要转向基于胶原的各向异性方法，以更好地再现天然 ECM 的组成和架构。
（三）生物力学性能
AF 在人体脊柱中承担着提供结构支撑和促进多种生物力学功能的重要角色。它主要承受沿圆周方向的拉伸力，其富含胶原的结构赋予它高拉伸强度和刚度，使其能够抵抗变形并维持椎间盘的完整性。同时，AF 组织还承受压缩载荷，PGs 在其中发挥关键作用，通过吸引和保留水分赋予组织抗压能力。此外，AF 还具有粘弹性行为，能够在脊柱运动时起到减震作用。
在开发 AF 体外研究模型时，需要考虑这些机械性能的数值。例如，AF 组织的拉伸应变范围约为 10 - 90 MPa，压缩模量在 0.4 - 3 MPa 之间。然而，现有大多数 AF 研究模型并未充分考虑这些机械性能。如 Chong 等人和 Molladavoodi 等人的模型，其机械性能与天然 AF 组织相差甚远。相比之下，AF 贴片研究在模拟天然机械性能方面取得了一定进展，如 Dewle 等人的聚己内酯支撑的电压实 Col I 贴片和 Borem 等人的脱细胞化心包支架。此外，整合有限元分析等技术有助于开发更真实、更具预测性的模型。
（四）AF 细胞来源
成熟的 AF 组织在稳态下细胞多样性高，细胞密度在 3000 - 9000 cells/mm3 之间。目前，虽然已提出一些 AF 细胞的标记物，但仍缺乏明确区分 AF 细胞与其他 IVD 细胞群体的标记物。
研究 AF 生物学和病理学时，可供选择的细胞来源多种多样。人类 AF 细胞可从手术获取的 AF 组织标本或尸体组织中分离得到，它们具有生理相关性，能为研究组织特异性反应提供重要信息，但存在获取困难、样本量受限和伦理问题。动物 AF 细胞来源广泛，包括啮齿动物、猪、牛等，它们易于获取且可重复性高，但不同物种间的差异不可忽视，同时也面临伦理和监管问题。间充质干细胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells，MSCs）可在适当条件下分化为 AF 样细胞，具有增殖能力强、来源广泛等优点，但存在细胞异质性高、分化效率和细胞表型不稳定等问题。诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）理论上可分化为多种细胞类型，包括 AF 样细胞，具有潜在的无限细胞来源和个性化治疗优势，但存在残留多能性、致瘤性风险以及分化效率低、细胞表型不稳定和成本高等问题。
在当前的 AF 研究模型中，约 50% 的研究使用人类 AF 细胞，未来应更多地将研究向人类细胞方向转化，同时探索 MSCs 和 iPSCs 在 AF 研究模型设计中的应用。
（五）稳态微环境线索
IVD 的独特微环境对细胞行为、ECM 合成和组织稳态有着重要影响。IVD 处于酸性、无血管、高渗和低氧的恶劣环境中，营养供应有限。
乳酸在 IVD 组织中高度积累，浓度在 2 - 6 mM 之间，导致组织 pH 值略呈酸性（7.0 - 7.2）。近期研究发现，乳酸的过量产生与 AF 细胞 ECM 合成能力的增加有关。IVD 组织的高渗透压是由其高含量的 aggrecan 和带负电荷的 GAG 链决定的，渗透压在静止时为 430 - 500 mOsm/L，日常活动时可降低 25%。目前已有研究使用 NaCl / KCl 溶液在体外再现这种渗透压。低氧与细胞和 ECM 代谢密切相关，研究表明，模拟低氧条件（2 - 20% O?）对培养的人类 NP 和 AF 细胞有不同影响，对 AF 细胞的影响相对较小。然而，目前的 AF 研究模型在实验设置中尚未考虑这些理化线索。
（六）AF 疾病模型的考虑因素
在设计 AF 疾病研究模型时，需要综合考虑机械加载、炎症和细胞间相互作用等因素，以更好地模拟体内病理过程。
- 机械加载：目前的 AF 研究模型在诱导疾病时大多未考虑机械刺激。然而，体外研究发现，循环拉伸应变（Cyclic Tensile Strain，CTS）装置可刺激人类 AF 细胞，导致炎症增加和 Col I 产生。循环机械拉伸（Cyclic Mechanical Stretch，CMS）在大鼠 AF 细胞中可诱导细胞凋亡，促进退行性疾病的发生。此外，适度的机械刺激可通过与小窝蛋白 - 1（caveolin - 1）和 Yes 相关蛋白（Yes‐associated protein，YAP）相关的途径逆转大鼠 AF 细胞的炎症。
近年来，体外生物反应器系统在椎间盘和其他软骨组织研究中取得了进展，如微流控方法和器官培养，这些技术能够更精确地模拟体内机械条件。例如，Chan 等人在生物反应器中对牛 IVD 进行单轴压缩和轴向旋转或扭转实验，发现 AF 组织中与基质重塑相关的基因上调。Jansen 等人开发的 “Spine Tester TO GO” 便携式设备，以及 Lazaro - Pacheco 等人定制的加载系统，都为体外 AF 研究提供了新的工具。2. 炎症：在诱导炎症微环境方面，目前的 AF 研究模型主要使用 IL - 1β、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和 TNF - α 等进行刺激。外源性给予 IL - 1β 和 TNF - α 是许多 IVD 组织研究的主要选择，它们在驱动炎症途径和组织退变中起着核心作用。然而，目前体外研究中炎症刺激的持续时间大多较短，一般为 72 小时以内，而 IVD 疾病中的炎症往往是慢性的。因此，在选择合适的细胞因子模拟炎症时，还需要考虑刺激的持续时间，进行更长时间的评估。3. 细胞 - 细胞相互作用：除了 IVD 细胞，其他细胞类型也参与了 AF 的疾病机制，包括免疫系统、新血管形成和神经系统相关细胞。
在免疫系统方面，研究发现 IVD 组织中存在免疫驻留细胞，但免疫细胞的招募机制尚不清楚。体外研究通过将 AF 细胞与免疫细胞共培养来模拟体内情况，如使用巨噬细胞样 THP - 1 细胞及其条件培养基成功诱导 AF 炎症微环境。此外，还应考虑其他免疫细胞，如 T 细胞和树突状细胞在 AF 疾病中的作用。
神经系统与 IVD 组织密切相关，AF 组织内存在神经支配，其对维持组织稳态和 IVD 退变都有重要影响。目前的研究通过与神经细胞共培养、评估神经突生长等方式探究神经系统与 AF 组织的相互作用，但由于使用的细胞系不能完全代表初级感觉神经元，在结果外推时需要谨慎。
IVD 在病理条件下会出现血管生成增加的现象。研究发现，退变的 IVD 样本中血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）表达显著上调，抑制抗血管生成因子（tenomodulin）会加剧 IVD 退变。因此，在 3D AF 研究模型中纳入血管生成相关研究，对于理解 IVD 突出中的血管化过程至关重要。
四、总结与展望
目前，研究人员距离理想的 AF 体外模型仍有很大差距。现有的生物材料选择在生化组成、架构和机械性能方面难以同时满足要求，往往需要在某些特性上做出妥协。从生物学角度来看，使用人类细胞并结合合适的微环境线索（包括稳态和疾病状态）也远未达到模拟天然过程的水平。
此外，AF 研究还应与 NP 和 CEP 模型相结合，研究它们之间的相互作用以及对 IVD 突出研究的相关性。同时，生物制造技术的进步，如器官芯片方法，有望为 AF 研究提供更复杂、更接近真实情况的模型，帮助研究人员更好地理解 AF 组织，揭示 AF 失效和 IVD 突出的机制，为改善患者的诊断和治疗效果提供有力支持。
