Nanopore 长读长 RNA 测序在人类细胞系转录水平分析中的系统性基准研究：解锁转录组奥秘

研究人员为评估长读长 RNA 测序技术研究转录表达的能力，开展 SG-NEx 项目，发现长读长 RNA 测序优势显著，为相关研究提供重要资源。

　　在生命科学的微观世界里，基因就像一本本神秘的 “生命之书”，记录着生物的各种遗传信息。人类基因组中蕴含着转录超 20 万种 RNA 的指令，然而，同一基因往往能产生多种高度相似的 RNA 转录本（即替代异构体），精确测定这些转录本的表达水平成了一大难题。

短读长 RNA 测序（RNA-seq）虽被广泛应用，但存在诸多局限性。例如，基于 PCR 扩增的测序会引入偏差，导致不同外显子的测序覆盖度不均；短读长数据在处理复杂转录事件时也力不从心，难以准确区分相似的转录本。

为了突破这些困境，来自新加坡等多地研究机构的科研人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Nature Methods》杂志上。

研究人员开展了新加坡纳米孔表达（SG-NEx）项目，对 5 种不同的 RNA 测序方案进行了系统的基准测试和比较。他们选取了 7 种常见的人类细胞系，包括结肠癌细胞系（HCT116）、肝癌细胞系（HepG2）等，并使用多种技术手段对其进行深入研究。

在技术方法上，研究人员运用了多种 RNA 测序技术，如 Nanopore 长读长直接 RNA 测序、无扩增直接 cDNA 测序、PCR 扩增 cDNA 测序、PacBio IsoSeq 以及短读长 cDNA 测序。同时，他们还引入了多种已知浓度的内参 RNA（spike-in RNAs），并进行了转录组范围的 N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）修饰分析。此外，研究团队开发了 nf-core/nanoseq 这一社区管理的流程，简化了数据处理和分析过程。

在研究结果方面：

• 全面的长读长 RNA-seq 资源：SG-NEx 核心数据涵盖 7 种细胞系，通过多种测序方案进行了多次重复测序，还包含多种内参 RNA 和 m⁶A 修饰数据。此外，研究团队还对多个额外细胞系和组织进行了测序，为研究提供了丰富的数据资源。
• nf-core/nanoseq 流程：该流程可进行质量控制、比对、转录本发现和定量、差异表达分析、RNA 融合检测以及 RNA 修饰检测等一系列操作，且各模块可灵活选择不同的现有方法，实现无缝集成。
• 五种 RNA-seq 方案的比较：在通量方面，PCR 扩增的 cDNA 测序通量最高；读长上，PacBio IsoSeq 平均读长最长，直接 RNA 测序次之；覆盖度上，长读长方案在转录本的 5′和 3′端覆盖度更高，其中直接 RNA 测序在 3′端覆盖度尤为突出；在转录本表达估计方面，不同方案存在差异，如 PCR 扩增的 cDNA 测序对高表达基因的转录本扩增比例较大，而 PacBio IsoSeq 数据则显示较短转录本的表达有所缺失。
• 基因表达估计的一致性：尽管不同测序方案存在差异，但在基因表达估计上具有较高的一致性。Nanopore 长读长 RNA-seq 数据的估计误差最低，与预期浓度的相关性更高，且与短读长 RNA-seq 数据在基因表达估计上高度相关，这表明两种数据可整合用于基因表达分析。
• 长读长更准确估计主要异构体：相较于短读长 RNA-seq，Nanopore 长读长测序在估计转录本表达丰度方面表现更优，能更稳健地识别主要异构体。通过对模拟碎片化数据的分析发现，读长碎片化会影响转录本表达估计，使短读长 RNA-seq 数据对某些异构体的表达估计偏高。实验验证也证实了长读长特异性主要异构体的丰度更高。
• SG-NEx 数据中的替代异构体表达：长读长 RNA-seq 数据中的全剪接匹配读段能够明确识别表达的替代异构体，研究发现不同细胞系中存在大量使用多种异构体的基因，常见的异构体差异包括外显子跳跃、替代启动子和替代最后外显子等，且异构体转换常涉及多个事件。
• 新转录本的发现：研究人员利用长读长 RNA-seq 技术在 SG-NEx 数据中发现了 1531 个新的多外显子转录本候选，这些新转录本在重复元件上显著富集，且部分参与了细胞系特异性的异构体转换事件。
• 融合转录本的发现与定量：通过对 6 种癌细胞系的研究，研究人员利用长读长 RNA-seq 数据鉴定出 106 个融合基因，其中 79 个已在先前研究或短读长数据中得到验证。长读长 RNA-seq 还能重建完整的融合转录本，平均每个融合基因可识别出 2 种由全剪接匹配读段支持的替代异构体。
• m⁶A RNA 修饰分析：利用 Nanopore 技术直接测序 RNA，研究人员在 7 种核心细胞系中发现了 6337 个预测的 m⁶A 修饰位点，部分位点在不同细胞系中具有特异性，且在癌基因 MYC 上发现了大量 m⁶A 修饰，表明直接 RNA 测序可同时分析 RNA 表达和修饰。

研究结论和讨论部分指出，SG-NEx 项目提供了当前 RNA 测序技术的系统资源和基准数据集，突出了不同文库制备和测序方法的差异。研究表明长读长 RNA-seq 在识别主要异构体、发现新转录本、定量融合转录本以及鉴定 m⁶A 修饰等方面具有重要价值，为转录组分析提供了更深入的视角。尽管长读长 RNA-seq 技术存在测序错误率较高等问题，但通过适当的方法可以有效解决，且其在研究复杂转录表型方面具有独特优势。该研究为转录组学研究提供了全面的资源和参考，有助于推动相关领域的发展，为进一步理解基因表达调控和疾病发生机制奠定了坚实基础。