FOXO4-SP6 轴调控表面上皮发育的研究新进展：解锁细胞命运密码

本文揭示了 FOXO4-SP6 轴在表面上皮（SE）发育中的关键调控作用，为相关疾病研究提供新方向。

　　

一、研究背景

表面上皮（SE）的正常发育对脊椎动物胚胎发生至关重要，它能形成表皮、角膜、口腔上皮以及毛囊和乳腺等重要结构。SE 发育异常会导致外胚层发育异常，影响外胚层附属器的结构和功能完整性。例如，外胚层发育异常蛋白（ectodysplasin）通路异常会引发皮肤、毛发、牙齿和汗腺发育不良；WNT 通路缺陷则会致使眼部形态发生失败。因此，探究 SE 发育的调控机制对发育生物学、再生医学以及先天性疾病研究意义重大。

细胞命运的决定受周围微环境信号的调控，包括细胞外形态发生素、细胞 - 基质相互作用和细胞密度动态变化等。众多人类多能干细胞（hPSCs）分化系统通过精确调节这些因素来诱导不同谱系的产生。比如，维甲酸（RA）和骨形态发生蛋白 4（BMP4）联合诱导可有效生成 SE 细胞；在高密度培养条件下，用小分子激活素 A、BMP4、CHIR99021 和 PD0325901 联合处理 hPSCs，可使其倾向于向 SE 命运分化。

超增强子是转录活性增强子的大簇，能驱动关键细胞类型特异性基因的表达并控制细胞身份。核心转录因子（TFs）在谱系定型过程中，对染色质重组、谱系特异性超增强子的调控以及谱系特异性基因的激活起着关键作用。虽然已有多个转录调节因子被报道参与 SE 发育的调控，如 GRHL2、TFAP2A、TFAP2C 和 GRHL3 等，但 SE 谱系超增强子的组成以及核心 TFs 介导其建立的机制仍不明确。

FOXO4 是叉头转录因子家族成员，在神经命运决定和辅助性 T 细胞 1 分化中发挥重要作用；SP6 是 Sp 家族转录因子成员，在牙齿形态发生和细胞滋养层生成中具有不可或缺的功能。本研究利用 KRT8 报告系统，发现 FOXO4 和 SP6 协同调节 SE 承诺，揭示了 FOXO4-SP6 轴在驱动 SE 承诺中的调控功能，为理解 SE 发育的分子机制提供了新视角，并为外胚层发育异常相关疾病的治疗干预提供了潜在靶点。

二、研究方法

1. 细胞培养与分化：人胚胎干细胞（hESCs）H1 和 KRT8 报告细胞系在 hESC 合格的基质胶（Matrigel）包被的培养板上，使用多能性生长培养基（mTeSR1）进行培养。为诱导 SE 分化，H1 hESCs 经消化成特定直径的细胞集落后，在含有 1 μM RA 的 mTeSR1 培养基中培养 7 天；诱导 SE 向角质形成细胞分化时，将 SE 细胞置于添加了特定生长因子的定义角质形成细胞无血清培养基（DKSFM）中培养 60 天；当细胞达到完全汇合时，用 1.2 mM CaCl₂处理衍生的角质形成细胞 7 天，诱导其终末分化。
2. 构建报告细胞系与基因敲低：运用 CRISPR-Cas9 系统构建 KRT8 报告细胞系，设计两个质粒对 H1 hESCs 的基因组进行编辑。利用 Merck 在线工具设计针对特定基因的短发夹 RNA（shRNA），将其亚克隆到 PLKO.1 质粒载体中，通过转染 HEK293T 细胞包装慢病毒颗粒，感染 hESCs 实现基因敲低，并通过实时定量逆转录 PCR（qRT-PCR）评估敲低效率。
3. 实验检测技术：采用 RNA 提取和 qRT-PCR 技术检测基因表达水平；通过免疫荧光分析检测细胞中蛋白的表达和定位；利用 RNA 测序（RNA-seq）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术，分别对转录组、染色质可及性和蛋白质与 DNA 的相互作用进行分析；运用基因集富集分析（GSEA）和基因本体（GO）富集分析，对基因功能和相关生物过程进行注释和富集分析。

三、研究结果

1. 鉴定关键 SE 调节因子：研究人员先前建立了 hESCs 向 SE 定向分化的模型，通过监测细胞形态以及 SE 标记物 KRT7、KRT8 和表皮主调节因子 TP63 的表达动态变化，确定了 SE 分化的关键阶段。为动态监测 SE 分化过程并发现关键转录因子，构建了 KRT8 报告 hESC 细胞系，该细胞系携带由 KRT8 调控的 ZsGreen 荧光蛋白。通过比较 hESCs 和 SE 起始细胞（D3）的转录组，筛选出 20 个在 SE 起始阶段高表达的转录因子，排除在 hESCs 中表达较高的基因后，选择 11 个转录因子进行进一步研究。敲低这些候选转录因子后发现，FOXO4、SP6、ELF3、MSX2 和 ZFP36L2 的缺失会显著降低 KRT8-ZsGreen 的表达，干扰细胞形态转变，表明这些转录因子参与调控 SE 发育。
2. FOXO4 在 SE 承诺中的作用机制：在候选转录因子中，FOXO4 敲低对 KRT8-ZsGreen 表达的抑制最为明显，因此深入研究其在 SE 承诺中的作用。FOXO4 的表达在 SE 起始阶段逐渐增加，在第 3 天显著升高。敲低 FOXO4 对 hESCs 的克隆生长和多能性维持没有影响，但会导致 SE 起始阶段转录组发生显著变化，许多 SE 标志性基因和关键调节因子的表达受到抑制，同时多能性因子的表达上调。基因本体（GO）富集分析显示，FOXO4 敲低细胞中下调的基因与上皮细胞分化、细胞命运决定和 BMP 信号通路调节等生物学过程密切相关。此外，敲低 FOXO4 会阻碍 SE 的成熟，基因集富集分析（GSEA）表明，SE 身份基因集与 FOXO4 敲低后下调的基因显著相关。

通过 ATAC-seq 分析发现，FOXO4 缺失会使 SE 起始阶段的染色质可及性景观发生深刻变化，与 hESCs 的染色质可及性状态高度相似，大部分差异染色质区域的可及性降低，且这些区域富含关键 SE 调节因子的基序。这表明 FOXO4 通过调节染色质可及性来调控 SE 承诺。

利用 ChIP-seq 分析发现，FOXO4 结合位点主要位于靶基因的启动子区域。整合转录组数据显示，FOXO4 敲低后差异表达基因（DEGs）的 57% 被 FOXO4 结合。进一步研究发现，FOXO4 通过调节 H3K4me3 修饰来调控基因表达，在 SE 分化过程中，FOXO4 结合到核心多能性调节因子 NANOG 和 SOX2 的启动子上，抑制其表达；同时结合到关键 SE 调节因子 TFAP2C 和 GRHL3 的启动子上，促进 H3K4me3 的沉积，从而调节它们的基因表达。3. SP6 作为 FOXO4 下游关键调节因子的作用：SP6 是 FOXO4 的直接调节靶点，敲低 SP6 会显著干扰报告 hESCs 向 SE 的分化。研究发现，敲低 FOXO4 会显著抑制 SP6 的表达，而敲低 SP6 对 FOXO4 的表达没有影响，表明 SP6 是 FOXO4 的下游调节因子。SP6 在 hESCs 中不存在，在 SE 起始阶段其表达显著升高。功能验证表明，SP6 缺失的细胞无法向 SE 谱系承诺，其 KRT8 和 TP63 的表达异常，细胞缺乏成熟阶段的特征性上皮形态。转录组分析显示，SP6 缺失会导致 SE 的标志性基因和关键调节因子在起始和成熟阶段均受到显著抑制，GSEA 证实这些下调的基因与 SE 身份基因显著相关。GO 分析表明，SP6 敲低后上调的基因与胚胎模式形成和干细胞维持等生物学过程相关，下调的基因与细胞命运决定、干细胞分化和对 BMP 的反应等发育过程相关。此外，SP6 和 FOXO4 缺陷细胞的转录组谱具有显著相似性，GSEA 进一步揭示了 SP6 敲低后抑制的基因与 FOXO4 破坏后下调的基因显著相关。4. SP6 对 SE 谱系特异性超增强子的调控：ATAC-seq 分析显示，SP6 缺失的细胞染色质可及性景观显著破坏，与 FOXO4 缺陷细胞相似。差异可及性分析发现，SP6 敲低后有大量差异 ATAC 峰，其中绝大多数峰的可及性降低，且这些峰富集了 SE 调节因子的基序，而可及性增加的峰则富集了多能因子的基序。

ChIP-seq 分析表明，SP6 主要结合在远端基因间区域，其结合位点富集了关键 SE 调节因子的基序。整合转录组数据发现，SP6 敲低后的差异表达基因中有很大一部分（66.7%）含有 SP6 结合位点，这些基因参与细胞分化和命运决定等生物学过程。进一步研究发现，虽然 FOXO4 和 SP6 的结合峰大部分不重叠，但它们的共同靶基因与泛上皮发育过程相关，表明二者在调节 SE 承诺中具有协同作用。

研究还发现，SP6 结合到大多数 SE 谱系超增强子上，这些超增强子与核心 SE 基因相关，GO 分析显示这些超增强子基因参与重要的上皮发育过程。敲低 SP6 后，SP6 结合的超增强子上 H3K27ac 信号显著降低，超增强子调节的基因表达也受到显著干扰。这表明 SP6 通过调节 SE 特异性超增强子来调控 SE 谱系特异性基因的表达。

四、研究讨论

本研究利用 KRT8 报告系统，成功鉴定出 FOXO4 和 SP6 是 SE 命运的关键转录因子，并揭示了它们形成的调控轴对 SE 承诺的控制作用。FOXO4 在不同谱系命运决定中发挥着不同的作用，在 SE 命运决定中，其表达在 hESCs 中较低，在 SE 起始阶段迅速增加，是 SE 承诺所必需的关键调节因子。

FOXO4 通过激活 SE 谱系特异性基因启动子上的 H3K4me3 修饰，正向调节靶基因的转录。H3K4 甲基转移酶家族成员如 MLL1/2、SETD1A/B、WDR5、DPY30 和 CFP1 等在转录共调节中负责调节 H3K4me3 修饰，进一步探究 FOXO4 与这些甲基转移酶的关系，将有助于更全面地理解 FOXO4 在发育中的调控机制。

FOXO4 和 SP6 的共同靶基因在泛上皮发育过程相关的 GO 术语中富集，表明它们协同调节 SE 谱系特异性基因。然而，它们具有不同的 DNA 结合模式，推测 FOXO4 可能通过与 SP6 协调，通过长程增强子 - 启动子相互作用来调节 SE 基因的表达，这值得在未来的研究中进一步深入探究。

此外，研究还发现 SP6 是 SE 起始的新型调节因子，它结合到大量 SE 谱系特异性超增强子上，调节 H3K27ac 的沉积，进而调控靶基因的转录。这与之前研究中 SP6 在滋养层发育中通过调节 H3K27ac 景观发挥调控作用的机制相似。

利用报告细胞系，研究还发现候选关键 SE 调节因子中的 ELF3 和 ZFP36L2 在缺失时也会干扰 KRT8 的表达，未来进一步探究它们对 SE 承诺的贡献以及与 FOXO4-SP6 轴的调控关系，将有助于更深入地理解 SE 发育的分子机制。

综上所述，本研究详细揭示了 SE 发育的分子机制，为理解 SE 命运决定过程中转录因子的调控原则以及外胚层发育异常的发病机制提供了重要依据，为相关疾病的治疗提供了潜在的新靶点和理论基础。