单细胞多组学解析小鼠和大鼠精子发生的分子机制：保守与差异

本文利用多组学技术，揭示小鼠和大鼠精子发生过程中的分子调控机制及物种差异。

　　

精子发生研究背景

精子发生是一个复杂的过程，在这个过程中，未分化的精原干细胞（SSCs）逐步分化，最终产生成熟的精子。这一过程涉及染色质调控、基因转录和蛋白质表达等多方面的显著变化。以往研究借助单细胞 mRNA 测序（scRNA-seq）对精子发生过程中的基因表达变化有了一定了解，然而，scRNA-seq 无法明确基因调控机制以及转录后对蛋白质丰度的影响。虽然单细胞表观遗传和蛋白质组学研究对精子发生的调控和转录后机制有一定揭示，但目前仍缺乏对染色质结构、转录和蛋白质表达变化的综合跨物种分析。小鼠和大鼠作为哺乳动物精子发生的经典模型，其从干细胞到精子的发育过程已较为明确，因此对这两个物种进行研究，有助于深入剖析精子发生的分子机制。

研究方法

研究人员对成年小鼠和大鼠的睾丸细胞展开研究，采用了两种单细胞工作流程：其一，将细胞核用于通过单细胞 / 单核 RNA 测序（sc/snRNA-seq）和单细胞转座酶可及染色质测序（snATAC-seq）联合检测基因表达和染色质可及性；其二，将完整细胞用于通过细胞索引测序技术（CITE-seq）联合检测基因和蛋白质表达。通过这些方法，能够在单细胞水平上直接关联表观遗传变化、基因转录和特定蛋白质表达。

研究结果

1. 无偏 scRNA-seq 聚类再现精子发生过程：通过无偏的 sc/snRNA-seq 聚类分析，研究人员对捕获的生殖细胞群体进行了鉴定。为更好地解析稀有前减数分裂细胞的分子特征，他们对 EpCAM 选择的细胞（富含生殖细胞祖细胞）和未选择的睾丸细胞都进行了分析。结果显示，所捕获的细胞呈现出已知的生殖细胞分化转录标记，并且在小鼠和大鼠之间，干细胞标记（如Nanos2和Ret）、精原细胞分化相关基因（Kit和Stra8）、减数分裂相关基因（Sycp3和Meiob）以及精子形成相关基因（Acrv1、Tnp1和Prm2）等方面具有高度的保守性。根据基因表达模式，研究人员成功划分了生殖细胞成熟的不同阶段，且发现小鼠和大鼠的对应细胞类型具有相似的基因表达谱。
2. 小鼠和大鼠生殖细胞的转录组相似性：尽管小鼠和大鼠的精子发生过程存在一些形态学差异，但二者所有已鉴定的生殖细胞簇均相同，且各阶段的精子发生标记也具有保守性。通过对基因表达相关性的评估发现，在物种内，小鼠和大鼠的有丝分裂、减数分裂和精子形成阶段的基因表达模式相似；在物种间，虽然相关性略低，但细胞类型的总体模式得以保留。通过伪时间分析，研究人员观察到生殖细胞形成了一个连续的细胞进展轨迹，并鉴定出了在物种间相关且共调控的基因模块。此外，研究还发现，许多表达基因在小鼠和大鼠的细胞类型中是共享的，但在精子发生后期，共享基因的数量和比例均有所减少。在转座子元件（TEs）表达方面，虽然部分 TEs 的表达具有物种和阶段特异性，但从减数分裂开始，TEs 的阶段特异性表达逐渐显现。
3. 信号网络和长非编码 RNA 表达的保守性：利用 Ingenuity Pathway Analysis 对不同阶段差异表达基因进行分析，研究人员发现干细胞阶段富集了与干细胞多能性、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）信号和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号相关的通路；未分化和分化的精原细胞中，细胞周期调控和氧化磷酸化通路显著富集；视黄酸（RA）信号在精原细胞和前细线期精母细胞中均有体现；减数分裂细胞在精子发生后期出现代谢转换，厌氧糖酵解和糖异生作用上调。同时，研究还检测到许多长链非编码 RNA（lncRNAs）在生殖细胞的不同阶段表达。通过对小鼠和大鼠 lncRNAs 的比较发现，虽然总 lncRNAs 数量在细胞类型间相对稳定，但随着精子发生的进行，共享 lncRNAs 的比例逐渐降低。部分 lncRNAs 在小鼠和大鼠中具有相似的表达模式，如Gas5在未分化精原细胞中表达，Tsirn1（小鼠）/LOC102546822（大鼠）在晚期分化精原细胞中特异性表达等，这表明 lncRNAs 在精子发生过程中可能发挥重要作用。
4. 小鼠和大鼠生殖细胞的转录组差异：研究人员鉴定出了小鼠和大鼠各细胞类型间的差异表达基因。例如，在 SSCs 中，Etv4、Cd9和Crabp1在大鼠中表达较高，而Gfra1、Foxp1和Zbtb16在小鼠中表达更高；在分化的精原细胞中，Dmrt1在小鼠中表达较高，Sycp3在大鼠中表达较高等。此外，研究还发现Gfra1在大鼠未分化精原细胞和早期精子细胞中均有 mRNA 表达，但蛋白质仅在未分化精原细胞中表达，这可能与新的Gfra1剪接变体有关。在对小鼠和大鼠未分化精原细胞的研究中，发现了 534 个差异表达基因，其中Id4在小鼠 SSCs 中是关键标记，但在大鼠 SSCs 中表达较低。进一步研究发现，在大鼠中，Etv5和Id4标记不同的未分化精原细胞群体，这表明Id4在不同物种中的功能可能存在差异。
5. 精子发生过程中的染色质可及性动态变化：男性生殖细胞成熟伴随着染色质可及性的变化，如含有组蛋白替代蛋白基因Tnp2和Prm1 - 3的染色质区域，在不同细胞类型中经历显著重塑，且在晚期圆形和早期伸长精子细胞中具有高可及性，与强烈的转录相关。通过对物种间染色质结构的比较发现，表观遗传特征在小鼠和大鼠之间具有显著的保守性。研究还发现，染色质可及性与基因表达之间存在关联，在早期减数分裂阶段，启动子可及性与基因表达的相关性最高，且在分化的精原细胞中，启动子相关峰的比例显著增加，这表明减数分裂基因的转录受到紧密的表观遗传调控。
6. 基因调控网络分析揭示保守的转录控制机制：利用 SCENIC + 对多组学数据进行分析，研究人员推断出增强子和启动子区域之间的联系以及转录因子（TF）与基因靶点之间的关系，从而确定了离散的 “调控子”。在小鼠和大鼠中分别鉴定出 174 个和 318 个调控子，其中 40 个调控子在两个物种中共享。这些共享调控子中，大多数在细胞按伪时间排序时表现出强烈的保守性。例如，TCF3 在精子发生早期被激活，ELF2 调控子在减数分裂期间被激活，ALX1 调控子在晚期减数分裂和精子形成阶段具有相似的激活模式等。这表明这些转录因子及其调控子对精子发生的正常进展至关重要。
7. Cd9 RNA 和蛋白质表达与假定增强子元件的相关性：以 CD9 为研究对象，分析其在精子发生过程中的表达情况。CD9 在小鼠和大鼠的 SSCs 中均有富集，研究发现Cd9的启动子在减数分裂前细胞中广泛可及，但启动子可及性与基因 / 蛋白质表达的相关性不佳。在两个物种中，Cd9第一内含子中的一个可及性峰与 mRNA 表达显著相关，在大鼠中，该峰与最高的 mRNA / 蛋白质表达相关，且下游峰比启动子区域与 mRNA 和蛋白质表达的相关性更强，这表明附近的假定增强子区域对Cd9表达的预测能力更强。此外，通过对大鼠睾丸细胞的流式细胞术分析，证实了可以根据 CD9 表达水平对精原细胞群体进行分类。同时，研究还发现参与减数分裂后单倍体生殖细胞的蛋白质（CD55、AIF1 和 SPAM1）存在翻译延迟现象，即 mRNA 表达峰值先于最大蛋白质检测时间。
8. 基因调控分析提供精子发生保守调控的整体视图：对小鼠和大鼠中保守的转录调控子进行分析发现，虽然转录因子表达及其调控子激活在物种间具有高度保守性，但下游靶点可能具有物种特异性。通过对 10 个在精子发生不同阶段活跃的调控子进行可视化分析，发现转录因子相关的峰可及性和相应基因表达与细胞类型密切相关，表明这些转录因子及其调控子在各自细胞类型中具有特定作用。此外，研究还发现一些转录因子对关键生殖细胞标记基因具有调控作用，同时也揭示了一些此前未报道的精子发生相关基因的潜在作用。

研究讨论

本研究通过联合 RNA/ATAC 多组学分析，全面描绘了小鼠和大鼠精子发生过程中的分子调控机制。研究结果不仅验证了一些已知的信号通路在精子发生不同阶段的作用，如 SSCs 中的 GDNF 信号、氧化磷酸化在有丝分裂阶段的变化以及减数分裂到精子形成阶段的代谢转换等，还发现了一些新的现象和潜在机制。例如，netrin 信号在晚期减数分裂 / 早期精子形成阶段的重要性，为深入理解精子发生过程提供了新的视角。

在染色质可及性方面，小鼠和大鼠表现出相似的模式，且在减数分裂期间基因表达与启动子可及性的相关性最强，这表明减数分裂过程中染色质可及性的严格调控对精子发生至关重要。lncRNAs 在精子发生过程中呈现出阶段特异性和保守性的表达模式，其功能值得进一步深入研究。

尽管小鼠和大鼠在精子发生过程中存在许多相似之处，但也存在一些显著差异。例如，Zbtb16在小鼠 SSC 维持中至关重要，但在大鼠中的表达明显降低；Id4在小鼠 SSCs 中高表达，而在大鼠中则标记不同的未分化精原细胞群体。这些差异提示不同物种在维持精子发生的分子机制上可能存在差异，值得进一步探究。

此外，研究还发现 CD9 蛋白的表达可用于识别特定的精子发生细胞类型，且一些保守的调控子在精子发生过程中可能发挥关键作用。已有研究表明，这些调控子中的部分转录因子（如 TCF3、DMRT1 和 PPARG）与男性不育相关，因此这些保守调控子有望成为男性不育诊断和治疗的潜在靶点。

综上所述，本研究通过对小鼠和大鼠精子发生的多组学分析，揭示了精子发生过程中的保守和差异机制，为深入理解精子发生的分子基础提供了重要依据，也为男性不育的研究和治疗开辟了新的方向。未来研究可进一步验证这些发现，并探索更多潜在的调控机制和治疗靶点。