超声驱动紫磷（VP）压电刺激修复神经的创新突破

本文报道了基于紫磷（VP）的超声驱动物理刺激策略用于神经修复，展现良好前景。

　　### 一、引言
神经损伤患者发病率高、预后差，传统治疗手段，如手术和生物组织工程面临诸多瓶颈，像抗生素耐药导致治疗效率低、传统光诱导疗法组织穿透性有限以及存在异位毒性等问题。因此，急需更安全、精准和有效的治疗策略。非侵入性物理刺激疗法备受关注，它借助物理响应性生物材料在生物微环境中产生活性氧（ROS）来发挥治疗作用。典型的物理动态刺激疗法包括声动力疗法（SDT）、热力学疗法、电动疗法、放射动力疗法、压电动力疗法和热释电动力疗法等，这些疗法在神经治疗中展现出一定潜力。

声动力疗法作为一种非侵入性且安全的治疗方式，能突破光动力疗法的深度限制，可通过组织中的超声（US）敏感注射纳米颗粒提高治疗效率，介导产生多种治疗性 ROS，如羟基自由基（?OH）、超氧阴离子（O^2·?）和单线态氧（¹O²）等，实现对受损神经的合理修复，且对神经组织具有良好的选择性，能避免对正常组织的脱靶毒性。然而，传统声动力疗法存在刺激效率有限的问题，主要是因为超声对治疗组织的非靶向性以及神经本身的多样性、复杂性和异质性。所以，开发具有超声响应、高生物安全性、超声可视化和理想神经营养特征的下一代非侵入性平台至关重要，但设计和理解这类多功能纳米治疗平台颇具挑战。

探索二维（2D）生物材料增强的声动力疗法为下一代声动力疗法神经修复平台的发展提供了关键思路。二维纳米材料因具有单原子或多原子厚度，在众多生物医学领域受到广泛关注，其超薄结构赋予纳米片（NSs）诸多独特的理化性质，如大比表面积和高电子迁移率等。特别地，其原子级厚度确保了在极低剂量下就能产生强烈的超声响应，为开发用于神经刺激的生物安全且多功能的纳米平台提供了可能。不过，选择合适的二维纳米平台至关重要，目前主要的二维纳米平台包括石墨烯家族和二硫化钨纳米平台等，但它们缺乏良好的生物降解性，限制了在生物医学领域的应用价值。

近年来，二维黑磷（BP）因其独特的光学和电子性质受到广泛关注，它在体内可降解为无毒的营养物质磷酸盐，生物相容性高，适用于多种生物应用。但黑磷在组织中不稳定，限制了其在神经声动力疗法中的应用。紫磷（VP）作为黑磷更稳定的同素异形体，具有层状结构，已实现稳定制备，并展现出一些独特的物理和光电性质。它结合了高开关比、各向异性电子性质、高载流子迁移率、宽带隙、稳定性和易于剥离等特性，在光子学、电子学和半导体领域具有广阔应用前景，在神经声动力疗法方面也颇具潜力。尽管紫磷在生物医学领域的应用逐渐兴起，但在神经修复尤其是神经声动力疗法方面的应用尚未见报道。鉴于紫磷独特的稳定性和物理性质，将其应用于声动力疗法是可行的，其优越的物理性质结合超声激发有望极大地促进神经修复。

二、结果与讨论

1. 材料表征
   通过多种理化和表面分析方法对紫磷、黑磷和石墨烯进行表征。紫磷具有独特的两层垂直叠加结构，与黑磷和石墨烯结构不同。原子力显微镜（AFM）表征结果显示，黑磷纳米片横向尺寸约为 4μm，厚度在 2.5 - 4nm；紫磷平均厚度约 15nm，为九层结构；石墨烯纳米片尺寸约 4.2μm，厚度约 8nm。

利用 AFM 的压电响应力显微镜（PFM）模块研究材料的压电性能，发现紫磷在 PFM 中所需电压和扫描偏压与黑磷、石墨烯不同，表明其响应性更强。紫磷、黑磷和石墨烯在压电响应相位滞后环中的相位变化分别约为 180°、200° 和 250°，紫磷的极化强度在最小能量下反转，其电滞回线面积、最大有效压电系数 d₃₃均表明紫磷具有更强的压电响应。这是因为紫磷正负电荷中心在机械拉伸或应变时沿不对称方向变化更大，导致更强的自发极化和更大的压电响应，这种独特的压电效应有利于基于紫磷纳米片开发物理治疗策略。

拉曼光谱、X 射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR 光谱）和 X 射线衍射（XRD）等进一步确定了材料的结构和理化性质。紫磷的拉曼光谱在 352、368、445 和 467cm^?1处有强信号，源于磷笼沿主链的呼吸和拉伸模式；石墨烯拉曼光谱有 D 峰（1578cm^?1）和 2D 峰（2673cm^?1）。XPS 光谱显示紫磷和黑磷在约 130eV 处有对应 P 2p_1/2和 P 2p_3/2的谱带，且都存在氧化磷（P_xO_y）峰，但紫磷和黑磷的 P:O 比不同，表明黑磷稳定性较差。FTIR 光谱显示黑磷的氧化状态比紫磷更强，进一步证实紫磷的稳定性。XRD 图谱显示紫磷具有明显的层状结构特征峰。
2. PC12 细胞在不同条件下的细胞毒性和分化性能
对 PC12 细胞进行细胞活力检测，评估紫磷的生物应用潜力。将不同浓度的紫磷、黑磷和石墨烯纳米片分散液与 PC12 细胞共孵育，结果表明在超声刺激下，三者与 PC12 细胞共存 7 天，细胞状态良好。在不同浓度材料作用下，PC12 细胞在 5μg/mL 时分化效果最佳。实验使用的磷浓度（5μg/mL）在细胞研究的安全范围内。进一步研究发现，即使培养 7 天，紫磷、黑磷和石墨烯对 PC12 细胞活力均无明显负面影响。

利用紫磷独特的刺激响应特性，在细胞水平研究其神经声动力疗法的再生功效。将 PC12 细胞分为对照组、超声组、激光组和超声 + 激光组，在神经诱导条件下分别与紫磷、黑磷或石墨烯共孵育 7 天，通过免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估细胞形态和分化情况。结果显示，在激光、超声或超声 + 激光刺激下，PC12 细胞神经元长度均增加。其中，在超声刺激下与紫磷共孵育的 PC12 细胞神经元长度增加最为显著，且神经突延伸也更明显，表明超声刺激下使用紫磷是加速 PC12 细胞向神经样细胞转化的有效策略，揭示了紫磷纳米片物理刺激促进神经修复的潜力。
3. 超声作用下的 ROS 活性
适当水平的 ROS 是神经元表型变化和维持细胞功能的逆行信号。使用 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 N - 氧化物（DMPO）作为捕获剂，通过电子顺磁共振（EPR）检测超氧阴离子和羟基自由基。超声刺激紫磷、黑磷和石墨烯分散液后，紫磷组和黑磷组均出现 DMPO/?OH 加合物的特征峰，且紫磷组自由基更多，整体治疗效果更好。紫磷的 ROS 信号在 10s 时就已产生，且大致与超声持续时间和紫磷浓度无关，意味着少量紫磷和短时间激发就能实现理想的 ROS 生成。黑磷 + 超声组除了出现黑磷原有的 DMPO 氧化物峰外，还有三个额外强峰，表明黑磷不稳定。EPR 结果有效证明了超声作用下紫磷对 ROS 响应的高开关比，这一特性有助于减少治疗损伤和副作用，支持基于紫磷的纳米治疗平台的构建和发展。
4. 紫磷的稳定性
已有报道表明紫磷比黑磷更稳定，本研究进一步证实了这一点。将黑磷和紫磷溶液在室温下孵育 7 天，黑磷溶液明显降解，而紫磷溶液保持稳定。对老化 7 天的紫磷和黑磷处理后的 PC12 细胞分化情况进行评估，发现老化 7 天的黑磷对 PC12 细胞分化基本无效，而老化紫磷与新鲜紫磷在细胞分化上无显著差异。通过电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）分析新鲜和老化 7 天的紫磷、黑磷的总磷浓度，结果显示黑磷在水溶液中暴露 7 天的降解率达到 40%，而紫磷降解率几乎为零，充分证明了紫磷的稳定性优势。目前紫磷在肿瘤学和抗菌治疗等生物应用中的动物实验周期为 9 - 18 天，这也表明紫磷是更稳定的候选材料。
5. 不同超声参数下紫磷促进 PC12 细胞分化
由于紫磷在超声下的出色响应特性，进一步优化超声激发条件，研究不同超声频率、占空比和振幅对 PC12 细胞分化的影响。结果发现，PC12 细胞向神经样细胞的转化明显依赖于超声占空比，在占空比为 40% - 50% 的组中，神经突长度和数量的表达最为丰富，定量分析表明占空比为 50% 时，超声能有效增加神经突长度和数量。在不同频率下，800kHz 超声作用下 PC12 细胞神经元长度增加显著。在不同振幅下，10W 超声时 PC12 细胞的存活和分化情况优于更低或更高功率的超声。综合来看，超声占空比为 50%、频率为 800kHz 时能与紫磷协同有效刺激 PC12 细胞分化。

钙离子在细胞分化中起关键作用，使用 Fluo - 4 AM 荧光染料标记钙离子，发现基于紫磷的压电策略（占空比 50%、频率 800kHz）能显著增加细胞内 Fluo - 4 荧光信号，证实细胞内钙离子浓度增加，表明钙离子可能在细胞分化中起关键作用，且紫磷诱导的细胞分化符合传统压电通路机制。
6. 体内生物安全性
为评估紫磷的生物安全性，对 8 周龄的 Sprague - Dawley（SD）大鼠在超声引导下进行鞘内注射紫磷实验。将大鼠随机分为生理盐水组、5μg/mL 紫磷组和 10μg/mL 紫磷组。超声成像证实紫磷成功注射到鞘内蛛网膜下腔。通过光镜和电镜观察脊髓、脑和内脏器官，结果显示鞘内注射紫磷 15 天后，脊髓无组织病理学异常。溶血试验表明紫磷血液相容性良好，且不会引起血常规指标异常。紫磷作为黑磷的同素异形体，在生物环境中可降解为磷酸盐，而磷是人体生物代谢过程中的必需元素，这些结果进一步表明紫磷在神经细胞甚至中枢神经系统组织水平上支持增强物理治疗的生物安全性，为进一步体内神经修复实验提供了重要的安全依据。

综上所述，本研究基于紫磷支持的声动力疗法，优化了压电策略用于神经修复。先研究紫磷的压电物理性质，再通过系统的细胞分化实验探究其声动力神经修复行为，最后利用小鼠鞘内注射模型研究生物安全性。研究发现紫磷具有明显的压电特性，在超声作用下对 ROS 响应的开关比优异，与黑磷相比，紫磷纳米片稳定性更高，声动力神经治疗性能显著提升。不同超声激发模式可调节 PC12 细胞的神经突延伸和生长，最佳参数为占空比 50%、频率 800kHz。钙离子成像表明紫磷诱导的细胞分化遵循传统的 Piezo1 压电通路机制促进神经细胞分化。本研究作为紫磷纳米片在神经治疗领域的首次探索，为磷同位素的生物应用提供了新思路和方法，为神经声动力疗法新型二维紫磷纳米平台的设计提供了有益见解。