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本文利用近红外二区（NIR-II）染料，通过优化白蛋白结合及定点突变技术，实现血睾屏障（BTB）完整性的无创成像。
一、引言
血睾屏障（Blood-Testis Barrier，BTB）如同睾丸内的一道坚固防线，由睾丸生精小管中支持细胞间的紧密连接构成。它在保护发育中的精细胞免受有害物质侵害、维持精子发生的稳定环境方面，发挥着举足轻重的作用。BTB 的完整性对睾丸的正常功能和调节至关重要，一旦其完整性遭到破坏，可能引发生育能力受损，还与多种病理状况密切相关。因此，评估 BTB 的完整性，在研究男性生育能力以及了解各种病症或治疗手段对睾丸功能的影响方面，有着极其重要的意义。
传统评估 BTB 完整性及伴随的精子发生受损情况的方法，存在诸多局限性。像苏木精 - 伊红（H&E）染色的组织学检查、免疫组织化学、透照辅助睾丸活检、生物素示踪剂的免疫荧光、镧示踪技术、睾丸 BTB 相关蛋白表达水平的蛋白质免疫印迹分析等，这些方法要么具有侵入性，会给患者带来痛苦；要么不够精确，结果的准确性存疑；要么只能进行体外分析，无法实时反映体内的真实情况。所以，迫切需要一种非侵入性、能够实时监测 BTB 完整性的成像技术。
近红外（Near-Infrared，NIR）荧光成像技术的出现，尤其是近红外二区（NIR-II）成像，为生物医学研究带来了新的曙光。与 NIR-I 成像相比，NIR-II 成像具有独特的优势，它的散射更低，就像光线在介质中传播时受到的阻碍更小；自发荧光极少，减少了背景干扰；空间分辨率更高，能够更清晰地呈现组织的细节。目前，与白蛋白非共价或共价结合的 NIR-II 探针，在血管成像、淋巴系统可视化和癌症检测等领域展现出了巨大的潜力。然而，这些探针在对复杂生理屏障（如 BTB）成像方面的潜力，尚未得到充分挖掘。BTB 将生殖细胞与体循环分隔开来，形成了一个免疫赦免部位，对精子发生至关重要。BTB 受损时会伴随白蛋白泄漏，基于此，开发与白蛋白结合的 NIR-II 染料，成为体内 BTB 受损成像的有效策略。研究人员推测，内源性和外源性白蛋白都能高效穿过受损的屏障，作为载体增强结合染料在屏障受损部位的积累，从而为动态可视化屏障完整性提供了契机。
基于此前的研究发现，一系列含氯菁染料能在生理条件下与白蛋白共价结合。在本研究中，研究人员致力于筛选出一种最优的亲白蛋白 NIR-II 染料，用于体内靶向和照亮 BTB 受损区域。他们探索了两个系列的含氯菁染料，包括具有 NIR-II 非峰值和峰值发射的染料（分别为 IR - 808 系列和 CO - 1080 系列），发现染料结构的差异会影响其与白蛋白的结合亲和力。体内成像结果表明，染料与白蛋白之间合适的结合亲和力，对 BTB 受损区域成像至关重要。结合能力过强会导致较高的背景信号，使 BTB 受损睾丸与正常组织相比，信噪比降低；而结合亲和力不足，则无法在 BTB 受损区域有效积累。此外，研究人员还推测，除了筛选具有合适结合能力的染料结构，通过突变野生型白蛋白来调节染料 - 蛋白质相互作用，也是一种可行的策略。
二、研究成果
（一）筛选适用于评估 BTB 完整性的白蛋白靶向染料
为实现高质量的 NIR-II 生物成像，筛选合适的白蛋白靶向染料是关键的第一步。研究人员精心挑选了六种之前优化过的 NIR-I/II 发色团，对它们与小鼠血清白蛋白（Mouse Serum Albumin，MSA）的发光和结合特性，进行了体外和体内测试。根据吸收和发射光谱，这六种染料被分为两组：发射峰在 NIR-I 窗口的 808 系列染料，以及发射峰在 NIR-II 窗口的 1080 系列染料（NIR-I 染料的尾发射可用于 NIR-II 成像）。
体外实验结果显示，在 808 系列染料与 MSA 的复合物（808@MSA）中，IR - 780@MSA、IR - 783@MSA 和 IR - 808@MSA 的亮度相近。但通过凝胶电泳和亮度统计发现，IR - 780 与 MSA 的共价结合更为完全。在 1080 系列染料与 MSA 的复合物（1080@MSA）中，CO - 1080@MSA 在亮度和共价结合能力方面表现出色。进一步研究发现，meso-Cl 和己烯基环的存在，对白蛋白结合能力至关重要，而 CO - 1080 适度的结合能力（比 808 系列染料弱），对 BTB 受损成像意义重大。
染料 @MSA 的高分辨率质谱分析进一步表明，808 系列染料和 CO - 1080 与白蛋白的结合效率较高，是体内白蛋白标记的潜在候选者。随后的体内成像实验中，研究人员在注射六种染料后的不同时间点收集小鼠血清，进行亮度测量和电泳分析。对比收集血清的 NIR-II 荧光带与相应的考马斯亮蓝染色结果，发现荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）的分子量在 60 - 75 kDa 之间，这表明血液中的丰富白蛋白确实充当了荧光染料的出色载体。其中，808@MSA 和 CO - 1080@MSA 展现出卓越的 NIR-II 亮度，证实了所选染料，尤其是 808 系列染料和 CO - 1080，在小鼠体内具有理想的白蛋白靶向能力。值得注意的是，静脉注射的染料与血液中的内源性白蛋白形成的 FPs 会被代谢和排出，部分代谢产物导致背景信号较低。研究人员推测，白蛋白靶向染料与白蛋白的快速结合，以及这些 FPs 在生精小管中的快速积累，对确保高质量的睾丸成像更为重要，因为睾丸中的代谢相对较慢，且具有出色的光稳定性。
（二）基于内源性白蛋白的 NIR-II FPs 评估不同程度的 BTB 破坏
为深入探究 808 系列染料和 CO - 1080 在评估 BTB 完整性方面的效果，研究人员构建了严重或可恢复性 BTB 破坏的小鼠模型。在注射筛选出的染料后的特定时间点，对比不同程度 BTB 破坏小鼠的全身成像和睾丸成像。
结果显示，尽管 808 系列染料通常具有较高的亮度，但由于其在皮肤 / 肌肉中的吸收较高，无法有效突出 BTB 破坏的睾丸。而 CO - 1080 具有适当的亮度和较低的皮肤 / 肌肉吸收（可能归因于其中等的白蛋白结合能力和较长的激发波长），更适合用于体内成像评估 BTB 完整性。此外，研究人员还发现，BTB 严重破坏的睾丸，其 NIR-II 亮度显著更高；而可恢复性 BTB 破坏的睾丸，亮度则较弱。这表明 BTB 破坏越严重，CO - 1080@MSA FPs 在睾丸中积累的速度可能越快。
研究人员进一步测量了注射 CO - 1080 后不同时间点小鼠睾丸和大腿皮肤的亮度，并对睾丸与皮肤的亮度比进行统计分析。注射 CO - 1080 后，血液供应丰富的正常睾丸仍能检测到不可忽视的荧光信号，但随着染料代谢，受完整 BTB 保护的正常睾丸亮度，会弱于 BTB 受损的睾丸。在注射 CO - 1080 后的 6 小时内，部分正常睾丸的亮度仍略高于严重 BTB 破坏的睾丸，这种亮度重叠现象直到 12 小时后才消失，此时睾丸与皮肤的亮度比（Testes-to-Skin Ratio，TSR）达到 4.0。亮度在 24 小时达到峰值，并在 168 小时后保持稳定，TSR 随时间逐渐增加，范围在 4.6 - 6.7 之间。这一趋势表明，在睾丸中积累的 CO - 1080@MSA 不易从体内排出。此外，可恢复性 BTB 破坏的睾丸在大多数时间点与正常睾丸的亮度差异不大，这让研究人员推测受损的 BTB 已部分恢复正常状态。
为确定 CO - 1080 在各主要器官中的积累情况，研究人员在 24 小时和 168 小时时间点解剖小鼠，取出主要器官进行 NIR-II 亮度测量和统计分析。在 24 小时时，严重 BTB 破坏的睾丸亮度甚至超过了肝脏，TSR 高达 7.4；而可恢复性 BTB 破坏的睾丸亮度更接近正常睾丸。最后，研究人员对睾丸切片进行 H&E 染色，染色结果显示，在严重 BTB 破坏模型中，大量生殖细胞从变薄或生理缺陷的生精上皮脱落；在可恢复性 BTB 破坏模型中，剩余的生殖细胞从相对完整的生精上皮向生精小管空腔中心延伸；正常睾丸中，生殖细胞紧密分布在完整的生精小管内。这些结果验证了 BTB 破坏模型构建的成功，进一步证实了 CO - 1080 在评估 BTB 完整性方面的有效性。
（三）使用 NIR-I/II 发色团进行双色成像和睾丸血管造影
除了对 BTB 破坏进行高对比度成像外，可视化破坏区域与周围血管的相对位置也至关重要。IR - 808 和 CO - 1080 在 808 nm 和 1064 nm 激发下具有不重叠的发射，这使得它们适合用于双色成像，能够同时观察 BTB 破坏情况和染料在睾丸血管中的流动。
在注射 CO - 1080 后的 24 小时，研究人员向 BTB 受损和正常小鼠体内注射 IR - 808。对于更高放大倍数的睾丸血管造影，只注射 IR - 808，并使用变焦立体显微镜 NIR-II 成像系统观察血管。在双色成像中，注射 IR - 808 后，睾丸血管立即清晰可见。对于 BTB 受损的小鼠，CO - 1080@MSA 在睾丸中的积累，使得研究人员能够捕捉到连续的双通道 NIR-II 成像，同时突出 BTB 破坏区域以及 CO - 1080 从血管进入睾丸的路径。而在正常睾丸中，尽管注射了 CO - 1080，但由于染料直接代谢，未在睾丸中积累，1064 nm 通道的荧光信号极弱。此外，通过变焦立体显微镜 NIR-II 成像系统以更高分辨率观察睾丸周围的局部血管，能更清晰地呈现血管细节。尾静脉注射 IR - 808 作为唯一的血管造影剂后，研究人员收集了一系列逐渐放大的血管图像，感兴趣区域（Region of Interest，ROI）内的信噪比约为 2.5，清晰描绘出了血管的线性横截面荧光强度，主血管和分支血管都清晰可见，并能在相应的信号轮廓曲线中识别出来。
（四）基于外源性白蛋白的 NIR-II FPs 快速评估 BTB 破坏
利用外源性白蛋白构建用于评估 BTB 破坏的 FPs，具有显著优势。在体外，白蛋白靶向染料能与白蛋白充分共价结合，从而最大化 FPs 的亮度和稳定性。这样一来，一旦 FPs 注入体内，它们就能在血液中循环，并迅速在睾丸中积累，与使用内源性白蛋白标记相比，大大缩短了诊断睾丸中 BTB 破坏所需的时间。
为避免可逆荧光猝灭并最大化 FPs 的亮度，研究人员在最佳结合条件下，将较低浓度的 FPs 在水浴中孵育，然后通过超滤浓缩，用于后续的体内成像。研究人员继续使用 CO - 1080 筛选合适的血清白蛋白，制备 CO - 1080@白蛋白，以快速评估 BTB 完整性。他们首先选择了五种哺乳动物血清白蛋白，测试了不同孵育条件下 CO - 1080@白蛋白的亮度。结果发现，虽然 CO - 1080@MSA 在室温下亮度较高，但加热后 CO - 1080@HSA 的亮度明显更高。CO - 1080@HSA 的凝胶电泳结果和相应统计分析表明，适当加热和延长孵育时间，能够增强 CO - 1080 与 HSA 的结合效率。
综合考虑亮度和结合特性，研究人员选择在 60°C 孵育 2 小时的 CO - 1080@HSA 作为评估 BTB 完整性的指标。由于其较低的皮肤吸收，尽管在睾丸中积累的 CO - 1080@HSA 亮度较弱，但经过数小时积累后，BTB 受损小鼠的 TSR 仍然可观。值得注意的是，在注射 CO - 1080@HSA 仅 6 小时后，BTB 受损睾丸和正常睾丸的亮度就出现了显著差异，此时 TSR 高达 4.5，且两者亮度无重叠。这表明，正如预期的那样，与单独注射 CO - 1080（需要在体内原位形成 FPs 后才能在破坏区域积累）相比，注射外源性构建的 CO - 1080@白蛋白在快速评估 BTB 完整性方面更具优势。
（五）CO - 1080 与突变型 HSA 的结合特性分析
鉴于 CO - 1080@HSA 出色的发光性能，研究人员进一步探究了 CO - 1080 与 HSA 之间的相互作用。先前研究表明，CO - 1080 倾向于与 HSA 的结构域 III（Domain III，DIII）共价结合，对 CO - 1080@HSA FPs 的蛋白质组学分析显示，DIII 中的 Cys477 和 Cys487 残基可能是 CO - 1080 潜在的共价结合位点，其中 Cys477 的得分更高，表明 CO - 1080 最有可能与 Cys477 共价结合。
由于 Cys461 和 Cys477，以及 Cys476 和 Cys487 各自能形成可逆的二硫键，研究人员预测，突变这些相关半胱氨酸，打破二硫键释放出 - SH 基团，可能会加速 CO - 1080 与 HSA 的结合。为初步确定蛋白质突变是否会影响 CO - 1080 与 HSA 之间的非共价亲和力，研究人员使用 Glide 程序进行非共价分子对接模拟。结果显示，所选半胱氨酸的所有单突变都增强了重组 HSA（Recombinant HSA，rHSA）与 CO - 1080 的非共价结合亲和力，其中 Cys476 的突变对增强这种亲和力的影响最大。
研究人员接着采用定点突变（Site - Directed Mutagenesis，SDM）方法制备了半胱氨酸突变为甘氨酸的 rHSA，并进一步研究共价结合位点的氨基酸突变对 CO - 1080 与 HSA 结合能力的影响。他们发现，在室温下，CO - 1080 与野生型 HSA 的共价结合极少。有趣的是，一些 CO - 1080@rHSA FPs 在室温下孵育后，就展现出了更好的 NIR-II 发光性能和理想的共价结合能力。其中，对白蛋白具有相对较强非共价亲和力的 rHSA - C476G，对 CO - 1080 仍表现出较高的共价结合效率。研究人员推测，一方面，Cys476 的突变和二硫键的断裂，扩大了 Cys477（潜在最佳结合位点）附近的蛋白质空腔，使 CO - 1080 在室温下更容易进入空腔，进而进行后续的共价结合；另一方面，暴露的 - SH 基团会大大提高 CO - 1080 的 meso-Cl 与 rHSA 的 - SH 之间亲核取代反应的速率。综上所述，突变型 HSA（包括 rHSA - C476G）在室温下对 CO - 1080 结合性能的改善，意味着在温和条件下构建 CO - 1080@rHSA FPs 用于 NIR-II 生物成像的可能性。
（六）基于温和条件下重组白蛋白的 NIR-II FPs 快速评估 BTB 破坏
综合考虑非共价亲和力和共价结合能力，研究人员最终选择 rHSA - C476G 来构建用于评估 BTB 完整性的 FPs。随着 Cys476 突变为 Gly476，修饰后的白蛋白空腔成为一个优化的微反应器，能够在温和条件下与 CO - 1080 共价结合。
研究人员将注射 CO - 1080@rHSA 的 BTB 受损小鼠作为处理组，将注射 CO - 1080@HSA 的 BTB 受损小鼠和正常小鼠作为对照组。所有 FPs 在室温下孵育 2 小时后进行实验。NIR-II 全身成像和睾丸成像结果显示，在评估 BTB 完整性方面，CO - 1080@rHSA 在亮度和 TSR 方面均优于 CO - 1080@HSA。值得一提的是，在注射 CO - 1080@rHSA 仅 3 小时后，BTB 受损睾丸和正常睾丸的亮度就没有重叠，此时 BTB 受损睾丸的亮度与正常睾丸相比，具有统计学显著差异，TSR 达到 3.1。此外，在注射 CO - 1080@rHSA（室温孵育）6 小时后的睾丸亮度和相应 TSR（达到 4.3），与注射 CO - 1080@HSA（60°C 孵育）6 小时后的睾丸亮度和相应 TSR 相当。由此可以得出结论，CO - 1080@rHSA 既保留了基于外源性白蛋白的 NIR-II FPs 皮肤吸收低、可快速评估 BTB 完整性的优势，更重要的是，它具有独特的优势，即通过简单混合 CO - 1080 和 rHSA 即可制备，无需加热。
三、讨论
研究人员成功证明了具有足够生物安全性的 NIR-II 染料，可作为一种非侵入性成像工具，用于评估 BTB 的完整性。研究发现，使用具有最佳白蛋白结合亲和力的含<研究人员成功证明了具有足够生物安全性的 nir-ii 染料，可作为一种非侵入性成像工具，用于评估 btb 的完整性。研究发现，使用具有最佳白蛋白结合亲和力的含氯菁染料，能够在体内以高特异性和敏感性实时可视化 btb 的破坏情况。实验结果清晰地展示了染料的白蛋白结合亲和力与成像质量之间的紧密关系。与白蛋白亲和力过高的染料会产生较高的背景（皮肤或肌肉）信号，这使得健康和受损的 btb>
随着 BTB 的破坏会导致白蛋白泄漏，设计与内源性白蛋白原位共价结合的白蛋白靶向染料，能够高效地靶向 BTB 的破坏区域。然而，由于生理条件下结合速度较慢，这种方法的成像时间窗口相对滞后。为了缩短快速确定 BTB 破坏所需的时间，使用合适的外源性白蛋白构建 NIR-II FPs 成为了一种可行的替代方案。研究人员通过对野生型 HSA 的二硫键位点进行突变，进一步优化了该系统。这使得蛋白质微反应器的单个巯基能够更有效地与 CO-1080 染料发生反应，产生了一种更稳定的 CO-1080@rHSA 探针。该探针可以在温和条件下通过简单混合制备，不仅提高了成像对比度，还加快了 BTB 评估的成像时间。这一成果也揭示了蛋白质突变在调节小分子与白蛋白亲和力方面具有巨大的潜力，为未来相关领域的研究提供了新的思路和方法。
在生命科学和健康医学领域，本研究成果具有重要的意义。对于男性生殖健康研究而言，这种无创、实时的 BTB 完整性评估技术，有助于深入了解睾丸生理和病理过程，为男性不育症的诊断和治疗提供了更精准的手段。同时，该技术在药物研发过程中，也可用于评估药物对睾丸微环境的影响，加速新型药物的开发进程。此外，研究中所涉及的白蛋白结合染料、定点突变技术以及 NIR-II 成像方法等，也为其他复杂生理屏障的研究提供了借鉴，有望推动整个生物医学领域的发展。
