揭秘共生新机制：Sodalis与寄生蜂的独特共生之旅

本文揭示Sodalis与寄生蜂Spalangia cameroni共生的传播机制，为早期共生研究提供新视角。

　　

引言

在自然界中，真核生物与微生物之间的共生关系至关重要。从微小的蠕虫到庞大的鲸鱼，从苔藓植物到维管植物，大多数生物都与微生物伙伴共同生存，许多生物甚至依赖这些伙伴来维持生存、发育和繁殖。互利共生的微生物能为宿主履行多种功能，比如产生宿主饮食中缺乏的营养物质、提供消化或解毒酶，或者帮助宿主抵御天敌、病原体和非生物胁迫 。作为回报，共生体在富含营养的栖息地中受益，并通常以高保真度垂直传递给宿主后代。垂直传播产生的伙伴保真反馈在强化互利共生互动中起着重要作用。

新的动物 - 微生物共生关系（广义的 “共生” 包括互利共生、寄生和共栖）可通过从环境中获取微生物，或通过水平传播从其他宿主获得共生微生物而形成。在这两种情况下，新共生关系的建立都是一个多步骤过程。微生物需要在宿主体内定植、繁殖，同时躲避宿主免疫系统，还可能要与其他微生物竞争空间和资源。此外，微生物还必须实现向宿主后代的传播。大多数细胞内昆虫共生体（如Buchnera、Wolbachia和Rickettsia）的垂直传播是经卵巢传播，即存在于卵母细胞内；而许多细胞外共生体则通过伴随卵子的分泌物进行母系传播，例如在一些蝽类物种中，通过母系 “乳汁” 分泌物传播，如采采蝇的共生体Wigglesworthia glossinidia和Sodalis glossinidius，还有像寄生蜂Nasonia中的Arsenophonus nasoniae通过注入毒液传播 。相比之下，共生体的父系传播相对罕见，仅有少数案例有记录，如叶蝉中的Rickettsia sp.、蚊子中的Asaia sp.、蚜虫中的Hamiltonella defensa以及采采蝇中的Sodalis glossinidius。然而，在新的共生关系中，这些不同的传播途径是如何演化的，目前还知之甚少。

本研究聚焦于寄生蜂Spalangia cameroni体内新发现的Sodalis属细菌共生体的获取和传播途径。Sodalis属是研究从自由生活到紧密宿主关联生活方式转变的有价值模型，其成员涵盖了从自由生活（如S. praecaptivus和S. ligni）到专性宿主关联（如S. pierantonius）的广泛生活方式。此外，Sodalis spp. 的细胞定位多样，从细胞内和细胞外（如采采蝇和吸虱）到严格细胞内（如象鼻虫中的S. pierantonius）、核内（在木虱中），甚至在另一种细菌共生体内（在粉虱中）。

Spalangia cameroni是家蝇（Musca domestica L.）和厩螫蝇（Stomoxys calcitrans L.）等蝇类的独居外寄生蜂，这些蝇类是畜牧业中的常见害虫。雌蜂用产卵器刺穿蝇蛹，注入毒液杀死蝇蛹，然后在蛹上产卵。孵化后，蜂幼虫以蝇蛹为食，在蛹内完成发育，最后从蛹上咬出的洞中羽化成为成虫。

Spalangia cameroni的Sodalis共生体最近被归类为自由生活物种Sodalis praecaptivus的一个新亚种，被认为是Sodalis相关昆虫共生体的环境祖先。因此，其正式名称为Sodalis praecaptivus subsp. spalangiae，在本文中简称为Sodalis SC。Sodalis SC 的基因组是Sodalis praecaptivus subsp. praecaptivus（以下简称Sodalis PP）基因组的退化子集，但由于插入序列元件和前噬菌体的大量增殖，其基因组大小（约 6.13 Mb）比Sodalis PP 更大。这以及系统发育分析表明，Sodalis SC 与Spalangia cameroni的关联相对于许多其他昆虫 - 细菌共生关系来说起源较新。这一特点与Sodalis SC 可在体外培养的事实相符，便于进行实验操作。在以色列的Spalangia cameroni自然种群中，Sodalis SC 仅在 16% 的黄蜂中被发现，且仅来自一个地点，并且总是与另外两种细菌共生体Wolbachia和Rickettsia同时存在。尽管这两种共生体以 100% 的保真度经卵巢传播，但初步实验表明，Sodalis SC 仅能传播给 60% - 80% 的后代。此外，在黄蜂卵母细胞中未检测到Sodalis SC，但在一些雄性睾丸中发现了它。因此，Sodalis SC 与Spalangia cameroni的关联显然是兼性的，但其传播途径和对适应性的影响尚不清楚。

本研究旨在表征Sodalis SC 的传播途径和机制。鉴于Sodalis SC 在Spalangia cameroni雌性卵母细胞中完全缺失，而在雄性睾丸中部分存在，研究人员假设该共生体利用非经卵巢的母系垂直传播途径和 / 或父系传播途径。因此，阐明这种新共生关系中的传播途径和感染动态，可能会为从自由生活到宿主关联生活方式的早期适应步骤提供重要见解。

结果

Sodalis SC 经黄蜂幼虫口部获取并母系传播给后代

研究人员让Spalangia cameroni成虫取食蜂蜜与Sodalis的混合物，或在含有Sodalis的琼脂平板上爬行，结果发现，60 只成虫中有 14 只（23.3%，95% 置信区间：13.4% - 36%）检测到Sodalis SC 阳性，但它们均未将该细菌传播给后代。相反，Spalangia cameroni幼虫获取Sodalis SC 的保真度要高得多（37 只中有 30 只，81%，置信区间：64.8% - 92%），无论是将Sodalis SC 悬浮液放置在幼虫旁边的蝇宿主上，还是将幼虫放在Sodalis SC 琼脂平板上几分钟后再放回宿主。而且，当这些幼虫发育为成虫后，它们将新获取的Sodalis SC 传播给了约 50%（置信区间：41.7% - 62.2%）的后代（F₁），F₁代又将其进一步传播给了约 80%（置信区间：78.3% - 87.2%）的 F₂代。这些结果表明，取食感染Sodalis SC 的蝇宿主有助于共生体的获取和向后代的传播。

Sodalis PP 也能被黄蜂幼虫获取，但不能传播给后代

鉴于上述结果，研究人员仅测试了通过向Spalangia cameroni蛹内幼虫提供Sodalis PP 时的获取情况。结果发现，46 只幼虫中有 44 只（95.6%，置信区间：85.2% - 99.5%）获取了Sodalis PP，但没有证据表明其能传播给后代。综合这些结果暗示，Sodalis SC 在被取食的黄蜂幼虫获取后，已经进化出了专门的适应性，以实现在Spalangia cameroni中的传播。

Sodalis SC 存在低频率的父系传播

研究人员选取 10 对 WRS 雄性（携带Wolbachia、Rickettsia和Sodalis SC）与 WR 雌性（携带Wolbachia和Rickettsia，但不携带Sodalis SC）进行杂交，产生了 129 只后代（79 只雌性和 50 只雄性）。在 10 个重复实验中，有 6 个重复的所有后代均为Sodalis阴性，另外 4 个重复共有 4 只Sodalis SC 阳性雌性和 6 只Sodalis SC 阳性雄性，加权平均后，F₁代Sodalis SC 阳性黄蜂的比例为 6.7%（置信区间：3.8% - 13.8%）。相比之下，阴性对照 WR × WR 杂交的所有后代均为Sodalis阴性（n = 20），阳性对照 WRS × WRS 杂交的 14 只后代中有 9 只为Sodalis阳性，符合Sodalis的平均传播率。为了测试新感染的女儿是否能进一步将Sodalis传播给后代，将它们与 WR 雄性交配并检测后代。结果发现，4 只雌性中，1 只产生的后代均为Sodalis SC 阴性，1 只产生了 16 只雄性后代（其中只有 11 只为Sodalis SC 阳性），另外 2 只雌性的后代均为Sodalis阳性。F₂代Sodalis阳性黄蜂的加权平均比例为 67.2%（置信区间：40.4% - 68.4%）。这些结果表明，Sodalis SC 存在低频率的父系传播，同时也伴随着高频率的母系传播。

Sodalis SC 定位于成年黄蜂的多种组织中，主要在毒腺

此前研究未在卵母细胞中检测到Sodalis SC，为了阐明该共生体的母系传播途径，研究人员利用荧光原位杂交（FISH）显微镜在成年黄蜂中进行了研究。结果发现，Sodalis SC 存在于一些雄性睾丸和脂肪细胞中，也存在于雌性营养细胞之间，但不存在于卵母细胞中，这与之前的发现一致。然而，令人惊讶的是，在雌性毒腺、毒囊以及肠道上皮细胞中观察到了高密度的Sodalis SC。高倍镜图像显示Sodalis SC 位于毒腺细胞内。在解剖的毒腺和毒囊中也观察到了Sodalis SC。解剖的毒腺和毒囊的整体 FISH 结果显示，这两个器官中均存在高密度的Sodalis SC。为了进一步确定Sodalis SC 是细胞内还是细胞外的，研究人员对仅携带Sodalis SC（即不含Wolbachia和Rickettsia）的黄蜂毒腺和毒囊进行了透射电子显微镜（TEM）分析。结果发现，Sodalis SC 存在于包裹毒囊的肌肉细胞内，其形态特征与体外培养的Sodalis SC 细胞相匹配。由于毒囊内容物的电子密度高，以及毒腺在制备过程中的易碎性，无法通过 TEM 确定Sodalis SC 在毒囊腔或毒腺内是细胞内还是细胞外。在阴性对照的无菌黄蜂中未观察到Sodalis SC。Sodalis SC 的定位模式强烈表明，它在注入毒液时随母系传播到蝇宿主，随后被取食的幼虫重新获取。

Sodalis SC 随毒液注入并随后被黄蜂幼虫获取

研究人员通过 FISH 检测寄生蝇宿主中Sodalis SC 的存在，以探究其可能的经毒液母系传播方式。结果发现，在注入毒液 4 天后，在蝇蛹的后部（黄蜂最常寄生的部位）角质层下的间隙中清晰可见Sodalis SC。接下来，研究人员追踪了Spalangia cameroni幼虫取食蝇宿主后Sodalis SC 的进入和定植情况。在取食幼虫接种 1 天后，在幼虫肠道腔内细胞外已可见中等密度的Sodalis SC；接种 3 天后，细菌出现在肠道上皮细胞内。在蛹期，Sodalis SC 存在于肠道腔、肠道上皮、神经系统和肌肉中。最终，在成年雌性黄蜂的毒腺和毒囊中再次观察到非常高浓度的Sodalis SC。研究人员还进行了卵交换实验，将 WR（即不含Sodalis SC）和 WRS（即含Sodalis SC）雌性的卵在被寄生的宿主之间交换，以测试是注入毒液还是产卵负责共生体的传播。结果发现，由 WR 雌性产下并转移到 WRS 雌性寄生宿主上的 53 个卵中，有 34 个（64.2%）发育成了 WRS 成虫。进一步测试发现，这些感染的成年雌性将Sodalis SC 传播给了 29 只 F₁代黄蜂中的 24 只（82.8%，置信区间：64.2% - 94.2%）。在相反的处理中，即 WRS 雌性产下的卵转移到 WR 雌性寄生宿主上，53 个卵中只有 2 个（3.8%）发育成了 WRS 成虫。这些结果支持了显微镜观察的发现，即Sodalis SC 在注入毒液时被接种到蝇蛹中，当幼虫取食感染的蛹时，能够传播给后代。

Sodalis PP 也定位于毒腺，但不能传播到蝇宿主

Sodalis PP 在肠道腔和肠道上皮中密度很高，在脂肪体、肌肉、生殖腺和 oenocytes 中密度较低。在毒腺 / 毒囊中也检测到了Sodalis PP，但其密度低于Sodalis SC。在卵母细胞和被人工感染该细菌的黄蜂寄生的家蝇蛹中均未检测到Sodalis PP。

只有Sodalis SC 能在被寄生的蝇宿主中成功传播和增殖，而Sodalis PP、Rickettsia和Wolbachia则不能

用被寄生的家蝇匀浆接种 LB 平板时，很快被污染物生长所覆盖，难以鉴定Sodalis SC。不过，PCR 检测成功在被寄生家蝇蛹（不含寄生蜂卵或幼虫）提取的 DNA 中检测到了Sodalis PP 和Sodalis SC。值得注意的是，在寄生后 2 - 3 天，被Sodalis PP 感染黄蜂寄生的 10 只家蝇蛹中，只有 4 只 PCR 检测呈阳性，而被Sodalis SC（WRS）黄蜂寄生的蛹中有 8 只为阳性。在后续取样的 6 - 7 天，被Sodalis PP 感染黄蜂寄生的 11 只家蝇蛹中只有 3 只呈阳性，而被Sodalis SC（即 WRS 黄蜂）寄生的 10 只蛹均为Sodalis SC 阳性。这些结果表明，Sodalis SC 已经进化出在被注入毒液的蝇宿主中增殖的能力，确保有足够数量的细菌通过幼虫取食建立感染。Rickettsia仅在 54 只被寄生家蝇蛹中的 4 只中通过 PCR 检测到，其中 3 只被Sodalis PP 接种的黄蜂寄生，1 只被 WRS 黄蜂（即携带Wolbachia、Rickettsia和Sodalis SC 的黄蜂）寄生。在这些被寄生的家蝇蛹中未检测到Wolbachia。综合来看，研究结果表明，Sodalis SC、Sodalis PP 和Rickettsia都随毒液注入家蝇蛹，但频率不同，只有Sodalis SC 能够在取食的幼虫中成功建立感染。这再次表明，Sodalis SC 已经进化出在被注入毒液的蝇宿主中成功增殖的能力，以促进后续的获取。

讨论

微生物与多细胞真核宿主之间形成稳定、长期共生关系的基本步骤之一，是建立一种强大的微生物跨代传播机制。尽管<>Sodalis SC 能够在两个远缘但生态相关的宿主中存活和增殖，其中一个宿主 —— 蝇类，会被毒液杀死。此外，研究人员用Sodalis PP 重复实验来测试这种共生关系的特异性。Sodalis PP 能够在某些昆虫宿主中建立感染并传播，本研究也发现它能感染Spalangia cameroni 。然而，尽管Sodalis PP 在注入毒液时成功接种到家蝇蛹中，但它似乎在蝇宿主中增殖能力不足，从而无法被后代获取。因此，Sodalis SC 通过黄蜂毒液的传播似乎构成了一种绕过生殖系的外部传播途径，这要求细菌具备特定的适应性，以便在次生寄生宿主中增殖。

这种传播机制与Arsenophonus nasoniae在Nasonia vitripennis中的传播非常相似。Arsenophonus nasoniae是一种寄生在丽蝇和麻蝇上的外寄生蜂，会导致N. vitripennis雄性死亡。它最初在黄蜂幼虫的中肠被发现，随后扩散到其他器官。后来，在N. vitripennis的产卵器中也观察到了它，它通过母系在产卵时接种到蝇宿主上，然后被取食的寄生蜂幼虫获取 。不过，这两个系统也存在一些显著差异。首先，Arsenophonus nasoniae的母系传播率更高（约 97%）。其次，Sodalis SC 存在父系传播，而Arsenophonus nasoniae仅通过母系传播。第三，Arsenophonus nasoniae是一种生殖操纵者，会导致雄性死亡，而Sodalis SC 未被观察到操纵后代性别比例。这种传播途径在两个不同的共生体 - 宿主系统中独立进化，这表明非经卵巢传播可能比之前认为的更为普遍。非经卵巢的垂直传播机制可能具有优势，因为它避免了细菌进入生殖系统中的卵母细胞或发育中的胚胎的必要性。此外，口服获取可能是昆虫从环境中获取潜在共生体的一种方式。因此，非经卵巢传播可能在新的共生相互作用中更为常见，在这种相互作用中，微生物伙伴仍能够在宿主外生存和增殖，Sodalis SC 和Arsenophonus nasoniae就是例证。未来研究寄生蜂中除了Nasonia和Spalangia之外，通过注入毒液传播共生体的现象有多普遍，以及（超级）寄生事件多久会导致寄生蜂物种之间或寄生蜂与被寄生宿主之间的水平共生体传播，将是非常有趣的课题。值得注意的是，在几个Spalangia cameroni种群以及同属物种Spalangia endius中也检测到了Arsenophonus。

虽然非经卵巢的母系传播在细胞外定位的共生体中很常见（例如在一些蝽科昆虫、社会性昆虫和狼蜂中 ），但细胞内共生体的非经卵巢传播例子却很少。这些例子包括采采蝇的共生体Wigglesworthia glossinidia和Sodalis glossinidius，它们通过母系乳汁分泌物传播给取食的幼虫；橄榄果蝇的共生体Candidatus Erwinia dacicola；以及芦苇甲虫的细胞内共生体Candidatus Macropleicola。

从机制角度来看，Sodalis SC 通过毒液而不是卵子传播，可能是因为毒腺 / 毒囊比卵子更容易接近。从幼虫到蛹再到成虫的变态过程涉及一些器官的广泛重建，如消化道、神经系统、部分肌肉等。而其他器官，包括眼睛、翅膀、腿和生殖器，则从在变态过程中不会降解的成虫盘持续发育。生殖细胞被生殖器成虫盘细胞包围，因此，生殖细胞可能对Sodalis SC 来说难以接近，而毒腺在变态过程中更容易接近。与Sodalis SC 不同，Wolbachia和Rickettsia通过卵巢传播 。这并不奇怪，因为这两种细菌作为节肢动物的共生体已经存在很长时间，系统发育分析以及与它们专性细胞内生活方式一致的大量基因组退化都证明了这一点。

Sodalis SC 在Spalangia cameroni毒液中的增殖可能需要特殊的适应性，因为外寄生蜂的毒液含有多种蛋白质、酶、微小 RNA 和卵巢液，这些物质共同作用可以麻痹或杀死宿主、抑制宿主免疫、增加宿主脂质含量并阻止宿主腐烂。后者在很大程度上是通过一系列抗菌肽（AMPs）实现的，这些抗菌肽也是先天免疫的重要效应物。Spalangia cameroni的毒液成分尚未被完全表征，但与之生物学相似的Nasonia vitripennis的毒液含有许多抗菌肽。细菌采用多种机制来抵抗抗菌肽，包括蛋白水解降解、生物膜形成、细胞膜分子改变和外排泵输出。Sodalis glossinidius和Sodalis praecaptivus都已被证明利用 PhoP - PhoQ 调节系统来感知抗菌肽的存在，并激活一系列酶来修饰脂多糖，从而介导对抗菌肽的抗性。值得注意的是，Sodalis SC 的基因组保留了完整的phoP、phoQ以及编码已知脂质 A 修饰酶同源物的基因。这与该细菌在含有阳离子抗菌肽多粘菌素 B 的培养基中生长的能力一致，研究人员在Sodalis SC 的生长培养基中添加多粘菌素 B 以促进选择性培养。因此，对抗菌肽的抗性可能是细菌定植昆虫并建立持久共生关系的关键特征。可以合理推测，对抗菌肽有抗性的细菌更有可能在寄生蜂毒液中存活和 / 或增殖，从而利用注入毒液的过程促进跨代传播。然而，也有可能在毒液中定植和存活需要比在其他体细胞组织中更高水平的抗菌肽抗性。换句话说，Sodalis SC 的 “超能力” 可能是极高水平的抗菌肽抗性。

为了确定毒液介导的传播是否是Sodalis SC 的特殊适应性，研究人员还对其最接近的亲属 —— 姐妹亚种Sodalis PP 进行了获取和传播实验。由于已知Sodalis PP 能够在某些昆虫中启动和维持感染，它为确定毒液介导的传播是否是Sodalis spp. 的固有能力提供了相关比较。当人工向取食的Spalangia cameroni幼虫提供Sodalis PP 时，幼虫很容易获取它，随后观察到它在雌性毒囊中建立感染，并在通过注入毒液（以较低水平）传播到家蝇蛹之前。然而，取食这些被注入毒液蛹的 F₁代黄蜂幼虫并未感染Sodalis PP，这意味着它在被注入毒液的蝇宿主中不如Sodalis SC 那样能够持续存在或增殖。这可能是因为Sodalis SC 从被寄生的蝇宿主中获取营养的能力更强。或者，这可能与前面提到的抗菌肽抗性有关，也许Sodalis SC 获得了对更广泛范围抗菌肽的抗性，包括家蝇宿主产生的那些。此外，Sodalis SC 可能在蝇蛹中具有防御功能，抑制或与可能对黄蜂幼虫致病的其他微生物竞争生长。那么，为什么Sodalis PP 在人工提供给黄蜂幼虫时能够被获取，但却不能传播给后代呢？第一代获取成功可以归因于黄蜂幼虫迅速取食了大量提供的细菌。相比之下，自然寄生时注入的含Sodalis毒液量非常少，而且幼虫从卵中孵化并开始取食大约需要 48 小时。因此，在这段时间里，与Sodalis SC 不同，Sodalis PP 可能无法充分增殖，从而无法让后续的幼虫定植。

如引言中所述，昆虫 - 细菌共生体的父系传播案例很少。其中一个例子是采采蝇中的另一种Sodalis（S. glossinidius），在 27.5% 的精囊中发现了这种细菌，随后在 17.4% 的后代中也发现了它。然而，目前尚不清楚Sodalis glossinidius是随精子细胞进入卵母细胞，还是从精囊迁移到雌性乳汁腺，然后转移到发育中的幼虫。目前，研究人员无法明确确定Sodalis SC 是位于精子细胞内还是细胞外，但父系传播杂交实验（感染雄性与未感染雌性杂交）产生了感染Sodalis SC 的雌性和雄性后代，这强烈表明Sodalis位于精子细胞外，因为膜翅目昆虫都是单倍体二倍体，雄性由未受精卵发育而来。此外，在卵交换实验中，来自 WR 雌性寄生宿主的 WRS 卵产生的后代中，有低频率的Sodalis感染，这可能是由于父系传播造成的。Sodalis SC 的父系传播可能抑制了雄性致死现象的进化（在Arsenophonus nasoniae - Nasonia vitripennis系统中观察到），因为Spalangia cameroni雄性可以在促进细菌传播中发挥作用，正如之前的模型所暗示的那样。

总之，Spalangia cameroni - Sodalis SC 的新生共生关系为研究共生关系早期阶段共生体的获取和传播机制提供了难得的视角。它还突出了一种特定于会向宿主注入毒液的昆虫的新型母系传播机制。最后，能够培养和操纵细菌共生体以及所需的昆虫宿主，为探索由这种非经典传播机制维持的共生相互作用提供了新的实验平台。