深度解析：体外蛋白聚集模型助力神经病理学研究

研究人员对比四种体外蛋白聚集模型，发现其诱导机制各异，为研究神经病理相关蛋白聚集提供重要依据。

　　在生命的微观世界里，细胞如同精密的小工厂，有条不紊地进行着各种生理活动，维持着生命的运转。蛋白质作为细胞的重要 “成员”，其正常折叠与代谢对细胞功能至关重要。然而，随着年龄增长和慢性应激的影响，蛋白质的 “生活秩序” 被打乱，出现聚集现象。这些蛋白质聚集体就像细胞里的 “捣蛋鬼”，与多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和帕金森病（Parkinson's disease，PD）紧密相关。

目前，全球有超过 5500 万人受到 AD 的困扰，且患病人数每 25 年就会翻倍。AD 患者的大脑中，淀粉样 β（amyloid beta，Aβ）肽在细胞外异常沉积，形成老年斑，同时，微管相关蛋白 tau 过度磷酸化，在细胞内形成神经原纤维缠结，这些病变严重破坏了神经元的正常功能，但至今仍没有有效的预防或恢复性疗法。PD 同样不容小觑，其特征是 α- 突触核蛋白（α-synuclein）聚集形成路易小体（Lewy Bodies），导致神经元死亡，患者出现运动障碍等症状。

为了深入了解这些疾病背后的分子机制，探索潜在的治疗靶点，来自葡萄牙阿威罗大学（University of Aveiro）的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Cellular and Molecular Neurobiology》杂志上。

研究人员主要运用了细胞培养、免疫印迹（Western blot）和免疫荧光显微镜（Immunofluorescence Microscopy）等技术方法。他们选用人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 和来自 80 岁人类供体的成纤维细胞进行实验。

线粒体破坏对神经细胞系整体蛋白聚集的影响

研究人员采用四种常见的体外蛋白聚集诱导方案，分别是用聚集的 Aβ_1-42肽处理、用鱼藤酮（rotenone）抑制线粒体呼吸链复合物 I、用寡霉素（oligomycin）抑制线粒体 ATP 合成以及用 MG-132 抑制蛋白酶体。通过荧光显微镜观察发现，与对照组相比，用聚集的 Aβ_1-42肽处理细胞后，蛋白聚集显著增加，是对照组的 14 倍。然而，尽管鱼藤酮和寡霉素会引起线粒体功能障碍，但它们处理细胞后，蛋白聚集并没有明显变化，这与以往一些研究认为的线粒体功能障碍会促进蛋白聚集的观点不同。而蛋白酶体抑制剂 MG-132 处理细胞后，蛋白聚集增加了 10 倍。此外，通过 Resazurin 检测发现，各种处理对细胞活力影响不大。同时，研究人员还发现，MG-132 处理会使热休克蛋白 70（Heat Shock Protein 70，HSP-70）表达增加，而 Aβ_1-42肽、鱼藤酮或寡霉素处理则不会改变 HSP-70 的水平，这表明 Aβ_1-42肽和 MG-132 诱导蛋白聚集的机制不同。

聚集体异质性：不同条件模拟不同生理现象

对聚集体形态的分析显示，Aβ 诱导的聚集体较大，倾向于聚集形成单个沉积物，这与 AD 中 Aβ 肽积累形成老年斑的过程相似，进一步证明了该模型在研究 AD 相关事件中的相关性。MG-132 诱导的则是几个较小的点状聚集体，与未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）和氧化应激相关。此外，研究人员通过蛋白质免疫印迹分析 α- 突触核蛋白水平，发现所有测试的聚集模型似乎都能使 α- 突触核蛋白水平增加，但诱导聚集形成最明显的 Aβ_1-42肽和 MG-132，并不是促进 α- 突触核蛋白积累最多的。其中，鱼藤酮处理最能诱导 α- 突触核蛋白聚集，这支持了鱼藤酮是研究 PD 的良好细胞模型的观点。

SH-SY5Y 细胞中聚集体形成与 tau^Thr231磷酸化增加相关

蛋白聚集通常与蛋白磷酸化和过度磷酸化有关。研究结果显示，MG-132 处理导致 tau 磷酸化增加最为明显，ptau/tau 比值几乎增加了两倍。虽然 Aβ 处理似乎也有增加 tau 磷酸化的趋势，但并不显著。此外，免疫荧光研究表明，磷酸化的 tau 会定位到 Aβ 处理后形成的细胞聚集体中，但 tau 在聚集体中的生理意义尚不清楚。同时，鱼藤酮处理使 tau 磷酸化略有增加，而寡霉素处理则使 ptau（Thr231）磷酸化比例降低。

APP 代谢不仅受 Aβ_1-42调节，还受蛋白酶体抑制的影响

tau 和淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein，APP）是与 AD 密切相关的两种蛋白。研究发现，MG-132 处理会调节细胞外分泌 APP（extracellular secreted APP，esAPP）和细胞内分泌 APP（intracellular secreted APP，isAPP）的水平。寡霉素可能会略微降低 APP 的分泌，而鱼藤酮对 esAPP 没有影响，但会使 isAPP 略有增加。Aβ_1-42肽处理则会导致 esAPP 减少，isAPP 增加，在人成纤维细胞中也得到了类似的结果，这表明 APP 代谢受到了阻碍。

在讨论部分，研究人员指出，Aβ_1-42肽处理神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 24 小时，能显著增加蛋白聚集，是研究 AD 中蛋白质稳态相关方面的良好模型。鱼藤酮虽然在本研究中对蛋白聚集影响不显著，但它能诱导 α- 突触核蛋白聚集，且其作用机制与 Aβ_1-42肽不同，是研究 PD 的有效模型。MG-132 作为蛋白酶体抑制剂，增加蛋白聚集的同时，还影响 tau 磷酸化和 APP 代谢，其诱导的聚集体具有典型的含有泛素化蛋白的特征。

这项研究通过建立和表征不同的细胞模型，为蛋白质聚集相关疾病的研究提供了有价值的工具。研究结果有助于深入理解 AD 和 PD 等神经退行性疾病中蛋白聚集的分子机制，为开发新的治疗策略提供了理论基础，在神经科学和医学研究领域具有重要意义。