探秘氨氧化菌中对氨基苯甲酸合酶：金属辅因子选择与催化机制新发现

为探究非典型对氨基苯甲酸（pABA）生物合成机制，研究人员分析欧洲亚硝化单胞菌 pABA 合酶，揭示关键残基及金属辅因子选择机制。

　　在微生物的世界里，存在着许多神秘而独特的生物化学反应，对氨基苯甲酸（para-aminobenzoate，pABA）的生物合成便是其中之一。pABA 是四氢叶酸（tetrahydrofolate）从头合成所必需的物质，在微生物的代谢过程中起着至关重要的作用。此前研究发现，在一些细菌中，pABA 的生物合成存在一条非典型途径，该途径依赖一种含有类血红素加氧酶结构域的氧化酶 / 氧合酶（heme oxygenase-like domain-containing oxidase/oxygenase，HDO）超家族成员，这是一种新型的自我牺牲酶，它能利用自身的氨基酸残基作为底物来合成 pABA 。

其中，来自沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的自我牺牲 pABA 合酶（“CADD”）备受关注。CADD 需要锰元素，可能采用异双金属 Mn/Fe 辅因子。然而，其催化 pABA 合成的机制尚未完全明确，且不同细菌中 pABA 合酶的特性是否存在差异也有待探索。为了深入了解这一神秘的生物合成过程，弗吉尼亚理工大学（Virginia Tech）的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是定点突变技术，通过该技术构建并分析 NePabS 的多个变体，探究特定氨基酸残基的作用；其次是液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术，用于检测 pABA 的生成以及分析蛋白质反应前后的肽段变化；蛋白质纯化技术也至关重要，通过镍亲和层析在厌氧条件下纯化蛋白质，保证实验的准确性。

下面来看具体的研究结果：

1. NePabS 的生产与纯化：研究人员将编码欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）pABA 合酶的基因 ne1434 插入 pET15b 载体，在大肠杆菌 BL21 中进行表达和纯化。金属分析显示，纯化后的蛋白质中铁的含量较低，表明其金属辅因子不稳定，体外重构也难以形成完整的二铁辅因子。
2. NePabS 的活性与金属特异性：通过酶活性检测实验发现，与 CADD 使用 Mn/Fe 辅因子不同，NePabS 在仅添加铁的反应中产生 pABA 的活性最高，这表明它可能采用更传统的 Fe/Fe 辅因子。但 NePabS 在体外产生 pABA 的转化率较低，不到 10%。此外，研究人员还发现，去除 His 标签或添加潜在底物都不能提高其活性。同时，定点突变实验表明，Tyr25、Tyr41 和 Lys159 对 NePabS 产生 pABA 至关重要，Tyr45 和 Trp99 可能参与自由基转移过程。通过18O2?掺入实验证实，NePabS 将分子氧中的两个氧原子掺入到 pABA 的羧基中。
3. NePabS 与 CADD 中不同芳香族残基的作用：对比 CADD 和 NePabS 的结构发现，CADD 中与双金属辅因子相邻的两个酪氨酸残基（Y170 和 Y141）在 NePabS 中被苯丙氨酸残基（F177 和 F148）取代。研究人员将这两个苯丙氨酸残基分别或同时突变为酪氨酸残基后发现，F148Y 变体对 Fe/Fe 和 Mn/Fe 的活性相似，F177Y 变体则明显将金属偏好从 Fe/Fe 转变为 Mn/Fe，而 F148/177Y 双变体对 Mn/Fe 有强烈偏好，且 pABA 产量比野生型酶提高了约两倍。这表明这两个酪氨酸残基在金属辅因子选择性和可能的自由基转移过程中起着关键作用。
4. NePabS 反应前后肽段分析：通过 LC-MS/MS 分析 NePabS 反应前后的肽段，确认了 Tyr25 是 pABA 合成骨架的牺牲供体，Lys159 是氨基供体。同时发现，野生型蛋白质中部分在大肠杆菌表达时就已发生反应，这也解释了其体外活性较低的原因。而 F148/177Y 变体在体外反应后，相关修饰肽段的丰度增加，与该变体体外 pABA 合成酶活性提高相符。

综合上述研究，研究人员证实了 NePabS 在 pABA 合成中的自我牺牲功能，揭示了其利用 Fe/Fe 辅因子的特性，且该特性与两个活性位点的苯丙氨酸残基有关，而这两个残基在 CADD 中为酪氨酸残基。这一研究成果为深入理解 pABA 生物合成机制提供了重要依据，有助于进一步探索微生物叶酸生物合成途径，为开发针对相关微生物的药物提供了潜在靶点。未来还需要进一步研究 NePabS 自我牺牲反应的详细机制，以及在体内控制其活性或引导蛋白质发挥其他功能的调控机制。