细胞外囊泡对氧化 DNA 损伤的保护作用：解锁精子健康新奥秘

研究人员开发方法评估细胞外囊泡（EVs）对 DNA 氧化影响，发现小 sEVs 表面可保护 DNA，为相关研究开辟新道路。

　　

研究背景：氧化应激下的 “遗传密码保卫战”

在微观的细胞世界里，氧化应激就像一场突如其来的风暴，时刻威胁着细胞的正常功能。当细胞内的氧化还原平衡被打破，过多的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）就会像脱缰的野马，肆意破坏细胞内的生物分子。其中，DNA 作为遗传信息的载体，首当其冲成为攻击目标。

DNA 氧化损伤会引发一系列严重后果，比如产生 8 - oxo - 7,8 - dihydro - 2’ - deoxyguanosine（8 - oxodG）等修饰加合物，进而导致 DNA 单链断裂（SSBs）。这些损伤若得不到及时修复，会阻断 DNA 复制、干扰转录过程，还可能增加遗传不稳定性，甚至诱导细胞凋亡，与多种疾病的发生发展密切相关，如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症以及不育症等。

Extracellular vesicles（EVs）作为细胞间通信的 “信使”，近年来备受关注。它们是由几乎所有功能细胞分泌的膜性颗粒，大小在 50 - 1000nm 之间，广泛存在于各种体液中。研究发现，EVs 参与多种生理过程，在疾病传播和药物递送方面也有潜在应用价值。然而，对于 EVs 是否能保护 DNA 免受氧化损伤，此前却鲜有人研究。

为了填补这一空白，来自西班牙多个研究机构的研究人员展开了一项深入探究，相关成果发表在《Biological Research》上。

研究方法：搭建细胞外 “遗传保护模型”

研究人员以猪精液血浆为研究对象，利用猪作为优秀的人类健康动物模型，且其精液血浆富含 EVs 的特点，开展了一系列实验。

研究人员从猪精液血浆中分离出两种不同大小的细胞外囊泡（sEVs），即小 sEVs 和大 sEVs。在实验中，研究人员采用了多种关键技术。首先，通过尺寸排阻色谱（SEC）法，成功将 sEVs 从精液血浆中分离出来，并对其进行纯化。接着，利用定量 PCR（qPCR）技术，检测 DNA 氧化损伤产生的 SSBs。该技术基于 SSBs 含有游离 3’ - OH 末端，可作为引物进行延伸，通过检测 SYBR 荧光强度来反映 SSB 的数量。为了验证 qPCR 结果的准确性，研究人员还使用了 Terminal dUTP Nick End Labeling（TUNEL）测定法。此外，研究人员通过蛋白质总浓度间接测量 sEVs 的含量，并运用流式细胞术对 sEVs 进行表征，分析其粒径分布、形态以及特异性蛋白标记等。

研究结果：小 sEVs 的 “抗氧化秘密武器”

1. qPCR - based 方法的开发与验证：研究人员将 pGADT7 - T 质粒转化到大肠杆菌中进行扩增，经检测，质粒浓度为 1.3mg/mL，260/280 吸光度比值为 1.875，且琼脂糖凝胶电泳显示无 DNA 降解。用不同浓度的 H₂O₂处理质粒 DNA 后，发现随着 H₂O₂浓度增加，SYBR/ROX 荧光比值呈剂量依赖性上升。当使用 0.325μg DNA 作为模板时，线性回归方程拟合效果最佳，表明 SSBs 的程度与 H₂O₂浓度相关。TUNEL 测定法也验证了这一结果，进一步证实了该 qPCR - based 方法的可靠性。
2. 两种 sEV 亚型的分离与表征：通过 SEC 方法，成功分离出小 sEVs 和大 sEVs。小 sEVs 的总蛋白浓度（0.37 ± 0.14mg/mL）显著高于大 sEVs（0.20 ± 0.06mg/mL）。小 sEVs 的粒径（133.30nm；129.77 - 136.08nm）明显小于大 sEVs（301.63nm；284.99 - 316.71nm）。此外，小 sEVs 大多呈圆形，大 sEVs 则形态各异，包括卵形和长形。两种 sEV 亚型在 EV 特异性蛋白标记 CD81 和 HSP70/HSC70 的阳性率相似，但小 sEVs 中白蛋白阳性事件的百分比（3.01 ± 0.39%）略高于大 sEVs（1.26 ± 0.97%）。
3. 小 sEVs 表面对氧化 DNA 损伤的保护作用：研究人员分别用非透化和透化的小 sEVs 和大 sEVs 与 H₂O₂和质粒 DNA 共孵育。结果发现，非透化的小 sEVs 能显著降低 SSBs 的程度（P <0.05），而大 sEVs 对 SSBs 的数量没有显著影响（P> 0.05）。透化后的小 sEVs 和大 sEVs 在减轻 SSBs 方面能力相似（P > 0.05）。这表明小 sEVs 对 DNA 氧化损伤的保护作用主要体现在其表面，而非囊内物质（IC）。
4. sEVs 的抗氧化活性分析：对 sEVs 的总抗氧化能力进行分析发现，非透化和透化的 sEVs 抗氧化浓度相似（P > 0.05），说明抗氧化分子主要位于 sEVs 表面。且小 sEVs 的酶促抗氧化活性（THIOLs）显著高于大 sEVs（P < 0.05），这进一步解释了小 sEVs 具有更强保护能力的原因。

研究结论与讨论：开启细胞外囊泡抗氧化研究新征程

本研究成功开发了一种基于细胞无 DNA 的损伤检测方法，用于评估 sEVs 对氧化 DNA 损伤的保护活性。研究结果表明，小 sEVs 的表面，包括外周冠层（PCL），能够发挥保护作用，抵御氧化机制引起的 DNA 损伤。这种保护作用可能是通过 PCL 上富集的抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）、谷胱甘肽 S - 转移酶 1（GSTP1）等实现的。

这一研究成果具有重要意义。一方面，为深入理解细胞外囊泡在维持细胞氧化还原平衡中的作用提供了新视角，有助于揭示精子在精液环境中抵御氧化损伤的机制，为男性不育症的研究提供了新方向。另一方面，该研究开发的方法可广泛应用于其他细胞类型或 EVs 的研究，具有普遍适用性。

然而，本研究也存在一定局限性。由于是体外研究，未考虑 EVs 与靶细胞的相互作用，且实验使用的是分离的 EVs，未涉及天然体液中其他活性成分的协同作用。未来的研究需要进一步完善这些方面，以更全面地揭示 EVs 在氧化应激调控中的作用。

总的来说，这项研究为细胞外囊泡的抗氧化研究开辟了新道路，为后续相关领域的研究奠定了坚实基础，有望在未来为人类健康和疾病治疗带来新的突破。