揭秘 p53 通路新机制：为癌症治疗开辟新方向

研究人员利用 CRISPR-Cas9 筛选，发现参与 p53 通路的基因和途径，为癌症治疗提供新靶点。

　　肿瘤抑制蛋白 p53 在人体中意义非凡，它就像基因组的 “守护者”，能对 DNA 损伤等多种细胞应激做出反应，维持基因组的稳定性。然而，令人遗憾的是，大约一半的人类肿瘤中都存在 p53 基因的突变。这一现状让科研人员意识到，深入了解 p53 通路对于癌症的治疗和诊断至关重要。

为了揭开 p53 通路的神秘面纱，来自耶路撒冷希伯来大学的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们利用全基因组 CRISPR-Cas9 功能缺失筛选技术，结合 Nutlin-3a（一种能抑制 p53-MDM2 相互作用，导致 p53 积累和细胞凋亡的小分子）处理细胞，试图找出那些能介导细胞对 p53 上调产生抗性的基因和通路。

这项研究成果意义重大，相关论文发表在《Molecular Medicine》上。研究人员通过一系列复杂且严谨的实验，得出了许多重要结论，为癌症治疗领域带来了新的曙光。

在研究方法上，研究人员主要运用了以下几种关键技术：一是全基因组 CRISPR-Cas9 功能缺失筛选，利用构建的针对 18,166 个蛋白质编码基因的突变文库，对细胞进行筛选；二是细胞生存实验，通过该实验来验证特定基因在 p53 介导的细胞死亡和生长抑制过程中的作用；三是 RNA 测序（RNA-seq），用于鉴定基因敲除（KO）细胞系中差异表达的 p53 靶基因 。

研究结果如下：

• 诱导 p53 水平升高：使用 Nutlin-3a 处理细胞，通过蛋白质免疫印迹分析（Western blot）证实 p53 蛋白水平显著增加。同时，通过细胞生存实验确定了用于全基因组筛选的 Nutlin-3a 合适浓度，分别为 14、16 和 18 μM。
• CRISPR 筛选识别相关基因：利用构建的突变文库对细胞进行处理，经过多轮筛选和分析，发现 736 个基因具有统计学显著的 CRISPR 分数（CS） ，其中 178 个基因富集。TP53 基因在筛选中最为富集，这进一步验证了 p53 在限制细胞增殖方面的重要作用。
• 识别参与 p53 介导细胞凋亡的基因和通路：在 p53 的 KEGG 通路基因中，Bax/Noxa（BBC3）/PUMA（PMAIP1）和 PTEN/TSC2 通路是最富集的，表明它们是 p53 调节细胞凋亡的重要下游通路。此外，还发现了 TRIP12 基因高度富集，它虽不属于已知的经典 p53 通路基因，但在研究中表现出重要作用。同时，功能富集分析显示，硫酸乙酰肝素（HS）糖胺聚糖生物合成、二磷酸腺苷核糖基化修饰（diphthamide）生物合成和 Hippo 通路相关基因显著富集。
• 基因功能验证：对 B3GAT3、B3GALT6、DPH1 和 DNAJC24 基因进行敲除验证，结果表明这些基因的敲除使细胞对 Nutlin-3a 的敏感性降低，证实了它们在 p53 介导的细胞凋亡中的作用。此外，通过使用 Hippo 通路抑制剂进行细胞生存实验，发现抑制 Hippo 通路能使细胞对 Nutlin-3a 的敏感性下降，突出了 Hippo 和 p53 通路在限制细胞生长和凋亡方面的协同作用。
• 探究 TRIP12 敲除细胞对 p53 上调敏感性降低的机制：创建 TRIP12 敲除克隆，研究发现敲除该基因不影响 p53 蛋白的积累，但会影响 p53 通路下游基因的转录。RNA 测序和实时定量 PCR（qPCR）结果显示，Noxa（PMAIP1）等基因在 TRIP12 敲除细胞中下调，而 CDKN1A 的表达不受影响，表明 TRIP12 通过干扰 p53 下游基因的调控影响细胞对 p53 上调的敏感性。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 p53 通路的新机制，发现了多个参与 p53 介导的细胞凋亡和生长抑制的关键基因和通路。这些发现不仅加深了人们对 p53 在肿瘤抑制中复杂作用的理解，还为开发针对癌症的靶向治疗提供了新的潜在靶点。然而，研究也存在一些局限性，如某些基因与 p53 通路之间的作用机制尚需进一步明确。但总体而言，这项研究为癌症治疗领域的发展做出了重要贡献，为后续研究奠定了坚实基础。