中国棘胸蛙肝脏表达抗菌肽 2（LEAP2）的多面免疫功能解析：开拓两栖类免疫研究新视野

本文聚焦中国棘胸蛙 LEAP2，揭示其抗菌与免疫调节功能，为两栖类免疫研究提供新视角。

　　### 一、研究背景
在生命科学领域，抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）作为对抗耐药菌的新希望，正吸引着众多科研人员的目光。随着抗生素耐药问题日益严峻，AMPs 凭借其广泛的抗菌谱和低耐药性倾向，成为研究的焦点。这些由带正电荷氨基酸组成的小肽，能与细菌细胞膜结合，破坏细胞结构，从而发挥抗菌作用，同时还具备免疫调节功能，在宿主免疫防御中意义重大。

肝脏表达抗菌肽 2（Liver-expressed Antimicrobial Peptide 2，LEAP2）是脊椎动物体内重要的 AMPs，在先天免疫系统中扮演关键角色，不仅能抵御细菌感染，还参与调节食欲、能量代谢以及生长激素信号通路。在两栖动物中，虽然已有关于崇安髭蟾和非洲爪蟾 LEAP2 的研究，但整体上对两栖类 LEAP2 的探索仍处于起步阶段。

中国棘胸蛙（Quasipaa spinosa）主要分布于东南亚，具有重要的商业和营养价值，却常受到细菌感染的威胁。本研究旨在深入探究中国棘胸蛙中 LEAP2（QsLEAP2）的功能，为两栖类免疫机制研究和新型抗菌疗法的开发提供重要依据。

二、研究方法

1. 实验动物：实验用中国棘胸蛙购自龙泉福溪农业发展有限公司，在实验室条件下适应两周后开展实验。实验期间，棘胸蛙饲养在 18 - 20℃的淡水中，投喂商业饲料。
2. 分子特征分析：从肝脏转录组中获取 QsLEAP2 的 cDNA 序列，利用 ProtParam 计算其编码蛋白的分子量和等电点，借助 SignalP 5.0 预测信号肽的切割位点，通过 AlphaFold2 对肽进行建模，使用 ClustalW 进行多序列比对，运用 MEGA X 软件构建系统发育树。
3. 基因表达分析：采集健康棘胸蛙的肝脏、脾脏、肾脏等多种组织，用于组成性表达分析。对棘胸蛙进行嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染实验，实验组腹腔注射 1.0×10⁴ CFU 的嗜水气单胞菌（1/10 的半数致死剂量 LD₅₀），对照组注射无菌生理盐水。在感染后 12 小时和 24 小时采集肝脏、脾脏等组织样本，保存于 - 80℃。提取样本总 RNA，反转录合成 cDNA，采用实时定量 PCR（qPCR）技术，以 Qs18S rRNA 为内参，通过 2^?ΔΔCt方法计算 QsLEAP2 的相对表达量。
4. 抗菌活性检测：化学合成纯度超 95% 的 QsLEAP2 成熟肽，采用改良的二倍稀释法测定其对多种细菌的最低抑菌浓度（MIC），包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）等。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估其对福氏志贺菌细胞膜的破坏作用，利用 DNA 水解实验检测其对福氏志贺菌基因组 DNA 的水解能力。
5. 免疫调节功能研究：运用 Transwell 小室实验检测 QsLEAP2 对 RAW264.7 小鼠白血病单核巨噬细胞的趋化作用；通过流式细胞术分析其对 RAW264.7 细胞吞噬 FITC - 葡聚糖能力的影响；采用 NBT 还原实验测定其对 RAW264.7 细胞呼吸爆发的作用。
6. 蛋白相互作用预测：从肝脏转录组获取 QsMOSPD2 的 cDNA，利用 SMART 软件预测其结构域，借助 AlphaFold2 服务器进行结构建模，使用 HDOCK 服务器预测 QsLEAP2 与 QsMOSPD2 的相互作用。
7. 统计分析：实验数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示，使用 SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），P < 0.05 视为差异具有统计学意义。

三、研究结果

1. QsLEAP2 的分子特征：QsLEAP2 的开放阅读框（ORF）由 288 个核苷酸组成，编码 95 个氨基酸，其蛋白包含信号肽、前结构域和成熟肽。成熟肽由 41 个氨基酸构成，相对分子质量为 4.80 kDa，等电点为 9.58。多序列比对显示，成熟肽比信号肽和前肽更为保守，其中 4 个保守的半胱氨酸残基形成两对二硫键。三维结构预测表明，成熟肽由 α - 螺旋和 β - 折叠组成。系统发育树分析发现，两栖类 LEAP2 形成独立于其他脊椎动物的聚类，QsLEAP2 与非洲爪蟾的 LEAP2 亲缘关系最为接近。
2. QsLEAP2 的表达模式：QsLEAP2 在多种组织中均有表达，在肝脏、肾脏和脾脏等免疫相关组织中表达较高，其中肝脏中的表达量是肌肉的 104.16 倍。感染嗜水气单胞菌后，肠道、脾脏和肾脏中的 QsLEAP2 表达持续上调，分别增加 6.66 倍、3.46 倍和 2.62 倍；而肝脏和肺脏中的表达则先升后降，峰值分别为 1.91 倍和 4.27 倍。
3. QsLEAP2 的抗菌活性：QsLEAP2 成熟肽对不同细菌的抗菌活性存在差异，对福氏志贺菌和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的抗菌活性最强，MIC 为 3.125 μg/mL；对肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）和金黄色葡萄球菌的抗菌活性次之，MIC 分别为 6.25 μg/mL 和 50 μg/mL；对华纳葡萄球菌（Staphylococcus warneri）的抗菌活性较弱，MIC 为 100 μg/mL；对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）等多种细菌则无抗菌活性。LDH 释放实验表明，100 μg/mL 的 QsLEAP2 可有效破坏福氏志贺菌的细胞膜。DNA 水解实验显示，50 μg/mL 和 100 μg/mL 的 QsLEAP2 能够降解福氏志贺菌的基因组 DNA。
4. QsLEAP2 对免疫细胞的调节作用：Transwell 实验结果表明，RAW264.7 细胞对 QsLEAP2 呈现明显的趋化反应，在 10.0 μg/mL 的 QsLEAP2 作用下，细胞迁移数量比牛血清白蛋白（BSA）对照组增加 2.83 倍。流式细胞术检测发现，随着 QsLEAP2 浓度的升高，RAW264.7 细胞对 FITC - 葡聚糖的吞噬摄取量显著增加，10.0 μg/mL 的 QsLEAP2 处理组的吞噬摄取量是 BSA 处理组的 2.54 倍。NBT 还原实验显示，QsLEAP2 能增强 RAW264.7 细胞的呼吸爆发，10.0 μg/mL 的 QsLEAP2 处理组的呼吸爆发强度是 BSA 对照组的 2.39 倍，且与佛波酯（PMA）共处理时，呼吸爆发增强更为显著，10.0 μg/mL 的 QsLEAP2 与 PMA 共处理组的呼吸爆发强度是 PMA 和 BSA 共处理组的 1.49 倍。
5. QsLEAP2 与 QsMOSPD2 的相互作用：通过 HDOCK 服务器模拟预测，QsLEAP2 与 QsMOSPD2 存在相互作用，结合模型的结合得分高达 - 332.01，置信度为 0.9744。QsLEAP2 主要结合在 QsMOSPD2 的 SCE14 和 Mptile_Sperm 结构域内的氨基酸残基上。

四、研究讨论

1. QsLEAP2 的结构与功能关系：QsLEAP2 的结构与其他已知的 LEAP2 类似，包含保守的半胱氨酸残基形成的二硫键，这对于维持其二级结构至关重要。在抗菌方面，它不仅能破坏细菌细胞膜，还能水解细菌 DNA，这种多模式的抗菌机制有助于降低细菌产生耐药性的风险。与其他抗菌肽如 cathelicidin 和 esculentin 的作用机制相似，QsLEAP2 在低浓度时可能通过非裂解机制抑制细菌生长，高浓度时则导致细胞膜破裂和细胞裂解。
2. QsLEAP2 的免疫调节功能：在脊椎动物中，LEAP2 具有免疫调节功能，但在两栖动物中的研究较少。本研究发现，QsLEAP2 能显著增强巨噬细胞的迁移、吞噬和呼吸爆发能力，这表明它在两栖动物的免疫防御中发挥着重要作用。其与 QsMOSPD2 的相互作用提示，可能存在受体介导的免疫调节途径，这为进一步研究两栖类免疫调节机制提供了新线索。
3. AMPs 的优势与应用前景：以 QsLEAP2 为代表的 AMPs 具有独特的优势。与传统抗生素不同，它们通过与细菌细胞膜直接相互作用发挥作用，不易产生耐药性。同时，AMPs 还具备免疫调节功能，能增强宿主的免疫反应，在清除感染的同时减少对共生微生物群的损害。此外，AMPs 具有病原体特异性，可针对特定病原体进行优化，降低菌群失调的风险，还适合与传统抗生素联合使用，减少药物剂量和毒性。尽管 AMPs 在生产和潜在细胞毒性方面面临挑战，但随着技术的不断发展，它们有望成为下一代治疗感染性疾病的有效药物。

五、研究结论

本研究成功鉴定并表征了中国棘胸蛙中的 LEAP2 同源物 QsLEAP2。QsLEAP2 对多种细菌具有显著的抗菌活性，能破坏细菌细胞膜完整性并水解基因组 DNA。同时，它还能诱导 RAW264.7 细胞的趋化作用，增强细胞的吞噬和呼吸爆发能力。通过模拟发现，QsLEAP2 与 QsMOSPD2 存在相互作用。然而，尽管在小鼠巨噬细胞模型中 QsLEAP2 展现出良好的免疫调节活性，但其在两栖动物宿主防御中的具体作用仍有待进一步研究。未来需要进行更多物种特异性的验证，以深入了解 AMPs 在非哺乳动物脊椎动物免疫中的作用机制，并评估 QsLEAP2 在两栖动物疾病治疗中的潜力。