综述：哺乳动物发育过程中复制时间的动态变化

本文综述了哺乳动物发育中复制时间（RT）的动态变化、调控机制及其对发育的影响。

　　# 哺乳动物发育过程中复制时间的动态变化：探索遗传信息传递的奥秘
在生命科学领域，哺乳动物的胚胎发育一直是备受关注的研究热点。其中，DNA 复制时间（Replication Timing，RT）的动态变化，如同隐藏在遗传信息传递过程中的神秘密码，对胚胎发育和细胞分化起着至关重要的作用。随着低输入基因组技术的飞速发展，科学家们对 RT 的研究也取得了一系列令人瞩目的进展。

胚胎发育过程中复制时间的出现与巩固

哺乳动物细胞在进行 DNA 复制时，会从基因组的多个特定区域（复制起点）启动复制，进而形成一个个复制结构域。这些复制结构域会在 S 期的特定时间段内完成复制，这一精确的时间调控机制就是 RT。RT 与基因组的组织特征密切相关，比如，晚复制区域通常对应 B 区室，而早复制区域则对应 A 区室；复制结构域大多与拓扑相关结构域（Topologically Associating Domains，TADs）相互对应。然而，目前尚未发现 RT 与其他结构域，如多梳相关结构域（Polycomb - associated domains，PADs）之间存在明确的联系。

RT 对于维持染色质状态和表观基因组的稳定至关重要，它在细胞命运的出现和稳定过程中发挥着基础性作用。因此，深入了解 RT 的分子调控机制，对于我们理解染色质状态的忠实传递和重新建立具有重要意义。多年来，RT 程序在发育和分化过程中是如何以及何时建立的，一直是科学家们努力探索的关键问题。直到最近，相关研究才取得了实质性进展。

研究发现，小鼠胚胎受精后，其 RT 模式并不明确。全基因组聚类分析结果显示，早期胚胎的 RT 程序与后期胚胎存在显著差异。在四细胞期胚胎中，清晰的复制结构域开始出现，这表明胚胎的 DNA 复制程序在这一阶段开始逐步建立。此外，通过对复制程序变异性的研究发现，从受精卵到四细胞期胚胎，复制程序的变异性得分最高，之后逐渐降低。对八细胞期和桑椹胚的全基因组 RT 值分布分析表明，这些胚胎的 RT 值呈现双峰分布，分别趋向于较早和较晚的 RT 值，而四细胞期胚胎则未出现这种现象。

值得注意的是，早期胚胎的 RT 特征还伴随着独特的缓慢复制叉速度。随着胚胎发育的推进，复制叉速度会逐渐加快。四细胞期胚胎的复制叉速度明显慢于囊胚期，这一现象进一步表明，四细胞期是细胞命运决定的关键分水岭，也是 DNA 复制参数重塑的重要阶段。

在受精卵和二细胞期胚胎中，虽然 RT 模式不明确，但与胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）相比，在某些特定区域仍存在明显的 RT 差异，且这些差异与基因表达模式一致。在早期胚胎中，还发现了源自父母本等位基因的 RT 差异区域。例如，在母本来源的着丝粒周围区域，其复制时间相对父本着丝粒周围区域较晚；而在二细胞期，母本来源的某些早期复制区域富含组蛋白标记 H2AK119ub 和 H3K27me3。这些组蛋白修饰由多梳抑制复合物（Polycomb Repressive Complexes，PRCs）沉积，通常在分化细胞中与兼性核纤层相关结构域（Lamina - associated domains，LADs）相关的异染色质区域富集。目前，虽然尚无直接证据表明 RT 与这些组蛋白标记之间存在因果关系，但研究发现 H3K27me3 标记的母本基因组区域在二细胞期会从核纤层解离，这与这些区域获得较早的 RT 谱相关。

DNA 复制过程中的风险管理

细胞在进行 DNA 复制过程中，如果出现异常，就会产生复制应激（Replication Stress），这是导致基因组不稳定的重要因素之一。复制应激的产生原因多种多样，包括复制叉进展速度异常、必需复制因子或辅助复制体因子的缺乏或调控异常，以及复制与转录之间的冲突等。

研究表明，四细胞期小鼠胚胎已经建立了明确的 RT 程序，但仍维持着早期胚胎的缓慢复制叉速度。这种复制特征的暂时解偶联会引发复制应激。目前，虽然尚未明确决定胚胎复制叉速度的具体因素，但在四细胞期补充核苷，能够加速复制叉的进展，减少 DNA 损伤反应（DNA Damage Response，DDR）标记物 Chk1 和 H2A.X 的磷酸化形式，显著降低分离错误事件的发生频率。在人类受精卵中，当受到干扰复制叉的药物（如聚（ADP - 核糖）聚合酶（Poly (ADP - ribose) Polymerase，PARP）抑制剂）处理时，也能观察到复制叉速度加快的现象。这表明，DNA 复制和 DDR 底物水平不足可能是早期胚胎复制叉进展的限制因素。然而，与囊胚期胚胎、ESCs 和胚胎成纤维细胞相比，这些处理后的复制叉速度仍然较慢，这意味着在胚胎发育的早期阶段，存在多种调控复制叉速度的机制。

在小鼠、人类和果蝇中，均有研究报道晚复制区域与突变率之间存在相关性。在小鼠四细胞期，超过 90% 的 DNA 断裂点分别出现在体外培养和体内环境下的中晚期或晚期复制区域。γH2A.X 作为 DDR 的常用标记物，在整个 DNA 复制过程中，通常会对复制应激产生信号响应，如在小鼠受精卵和人类癌细胞中。在四细胞期早期 S 期复制的区域未检测到断裂点，这可能是因为这些区域更易被修复，因为常染色质对修复因子的可及性更高，但也不能排除基因组脆性差异的影响。因此，早期复制区域更有利于维持基因组的完整性，减少异常核型的诱导。

此外，有研究推测，早期植入前胚胎可能通过调控 DNA 复制来程序性地诱导复制应激，这或许有助于胚胎的发育和分化过程。例如，在造血细胞中，dNTPs 的消耗诱导复制应激能够促使细胞分化；在幼稚 B 细胞中，ATR 通过调节早期 S 期 dNTPs 的含量来调控 DNA 复制速度；在 ESCs 中，γH2A.X 参与维持细胞的干性。然而，关于早期胚胎中复制应激以及 DDR 是否与 DNA 链断裂相关，目前仍存在争议，有待进一步深入研究。

细胞可能会通过负选择机制，将激活 DDR 的细胞从特定的细胞命运谱系中清除。例如，胎盘等胚胎外组织的嵌合率高于胚胎组织，这种现象被称为局限性胎盘嵌合体（Confined Placental Mosaicism，CPM），它表明机体可能存在一种保护机制，以防止具有异常核型的细胞转移到胚胎中。目前，早期胚胎将异常核型细胞分配到胚胎外组织的具体机制尚不清楚，但有研究发现，人类二细胞期胚胎中分裂较快的卵裂球在囊胚期更频繁地参与形成内细胞团（Inner Cell Mass，ICM），这提示细胞周期的长短可能在这一机制中发挥重要作用。

调控 RT 的潜在机制

RT 与细胞的多种特征密切相关，如基因表达、染色质可及性和 3D 基因组结构。这些特征之间也存在着复杂的相互关联，尽管它们之间的因果关系目前才刚刚开始被揭示。3D 基因组结构被认为是预测 RT 的重要因素之一，随着 ESCs 的分化，TADs 的变化会与 RT 的变化同步发生。然而，当在受精后的初始转录浪潮（合子基因组激活，Zygotic Genome Activation，ZGA）过程中，使用 5,6 - 二氯 - 1 - β - D - 呋喃核糖基苯并咪唑（5,6 - dichloro - 1 - β - D - ribofuranosylbenzimidazole，DRB）抑制 RNA 聚合酶 II（RNA Polymerase II，RNA Pol II）的延伸，或者使用 α - 鹅膏蕈碱降解 RNA Pol II 蛋白本身来抑制 ZGA 时，会观察到 LAD 分布发生显著重塑，但 RT 仅受到轻微影响。在人类癌细胞中，敲除环挤出的关键调节因子黏连蛋白（cohesin），虽然不会对 RT 模式产生全局影响，但插入 TAD 边界却能导致 RT 从晚期向早期发生显著转变，这表明结构边界能够决定性地影响 DNA 复制的起始。这些研究结果表明，虽然 LAD 分布在稳态下与 RT 相关，但它们的变化并不总是与 RT 的动态变化一致。同时，对小鼠胚胎的研究还发现，RNA Pol II 的加载而非延伸，在 ZGA 基因的 RT 调控中起着重要作用。

在细胞（包括胚胎）中，核小体的定位与活跃转录位点高度一致，这些位点是 RNA Pol II 结合染色质启动转录的区域。核小体的精确定位为加载复制前复合物或起始许可提供了稳定的支架，这对于启动 DNA 复制至关重要。类似的，G - 四链体基序也会影响复制起点的定位和复制效率，但其具体影响 RT 的机制尚不完全清楚。

通常情况下，转录因子（Transcription Factors，TFs）与靶 DNA 结合时，需要先将启动子区域的核小体移除，因为染色质会对 TFs 的结合形成强大的阻碍，不过先锋转录因子除外。在 ZGA 之前的早期胚胎中，染色质结构（包括核小体位置）在全局上并不明确。当锌指转录因子 YY1 缺失时，有序的核小体位置景观的形成会受到干扰，这表明染色质结合因子在决定核小体位置方面发挥着积极作用。核小体位置在整个基因组中都有明确的定义，不仅包括与 RNA Pol II 结合并转录的区域，还包括转录沉默的区域。因此，探究这些区域在发育和分化过程中的形成机制，以及它们如何影响 DNA 复制因子的结合、后续复制起点的激活和 RT 的调控，具有重要的科学意义。目前，由于缺乏适用于哺乳动物胚胎等低输入样本的复制起点确定技术，期待相关技术的进一步发展，能够为我们深入理解哺乳动物发育和分化过程中的 DNA 复制机制提供更详细的信息。

Rap1 相互作用因子 1（Rap1 - interacting factor 1，Rif1）是目前研究较为深入的 RT 调节因子之一，也是已知的唯一一种既能影响染色质组织又能影响 RT 的蛋白质。在人类细胞中，Rif1 的缺失会导致 RT 几乎完全丧失，同时还会引起活性（H3K27ac）和抑制性（H3K9me3）组蛋白修饰的显著重新分布，以及 3D 基因组结构的改变，并且这些表型会在后续的每个 DNA 复制周期中逐渐加剧，这表明 RT 在调控表观基因组方面发挥着重要作用。在小鼠胚胎发育过程中，受精后全长 Rif1 蛋白的表达水平会因截断而显著降低，在八细胞期 RT 明确时又会上调。在四细胞期敲低 Rif1，对该阶段的全局 RT 影响不大，但从八细胞期开始，会明显抑制 RT 的巩固，这说明在早期胚胎中，Rif1 在胚胎发育过程中对 RT 的巩固起着关键作用。有趣的是，虽然 Rif1 缺失也会导致四细胞期和八细胞期胚胎的 LAD 分布发生变化，但这些变化与 RT 的变化并无相关性。在斑马鱼、青蛙和果蝇等物种中，Rif1 同样参与 RT 的调控，但敲低 Rif1 后产生的表型各不相同，包括性别决定异常、胚胎发育速度加快且眼睛变小、存活时间极短且不育等。这些研究结果表明，Rif1 在不同物种中均参与 RT 的调控，但其在 RT 中所起的作用以及缺失后的影响，会因物种和细胞类型的不同而有所差异，这从分子生物学和进化的角度来看极具研究价值。

未解决的问题与展望

尽管目前在 RT 的研究方面已经取得了诸多进展，但仍有许多关键问题有待解决。例如，RT 与复制叉速度之间的关系究竟如何，它们的分子调控机制是什么？母源偏向性区域中富含的 H3K27me3，在受精后从核纤层脱离且复制时间早于父源染色体上的对应区域，这两者之间存在怎样的联系？RNA Pol II 精细调节 ZGA 基因 RT 的分子机制是什么？早期胚胎中参与 Rif1 截断的因素有哪些？体细胞中 Rif1 的截断能否重现早期胚胎中的 RT 模式，除了 Rif1 之外，是否还有其他因素塑造了早期胚胎特定的 RT 模式？此外，RT 的变化能否驱动发育、分化和细胞命运决定，进而改变组蛋白标记、基因表达和 3D 基因组结构，还是说存在相反的调控关系？

随着研究技术的不断进步，未来有望对这些问题进行深入探究。相信在接下来的十年里，RT 领域的研究将进一步丰富不同细胞类型和疾病中的 RT 数据库，并建立能够直接操纵 RT 的系统，以明确其对细胞命运决定的影响。回顾过去十年，RT 领域在众多科研人员的努力下取得了显著进展，但仍有许多未解之谜等待我们去探索。希望这篇综述能够激发更多科研人员在该领域开展实验和理论研究，为揭示生命遗传信息传递的奥秘提供更多的线索和理论支持。