衰老相关基因回路的设计原则

本文聚焦酵母衰老基因回路，揭示反馈回路对维持细胞平衡的作用，为延缓衰老提供策略。

　　

衰老研究的新视角：基因调控网络（GRNs）

衰老，是一场发生在细胞层面的 “持久战”，由细胞损伤和体内平衡基因调控网络（GRNs）的紊乱共同驱动。以往对衰老的研究，常像在黑暗中摸索单个亮点，聚焦于单个基因，却忽略了基因间相互作用这一解开衰老机制的关键密码。如今，随着研究的深入，科学家们将目光投向 GRNs，试图从系统层面解读衰老过程中基因的 “互动交响乐”。

GRNs 就像一张复杂的 “基因电路地图”，节点代表基因或调控元件，边则描绘着它们之间的相互作用。位于网络中心、连接紧密的节点，如同乐团的指挥，主导着细胞对各种刺激的反应。而网络基序作为其中反复出现的 “小插曲”，虽结构简单却意义非凡，像正自调控能确保基因持续活跃，负反馈回路则是维持细胞内环境稳定的 “忠诚卫士”，一旦细胞状态偏离正常范围，它便迅速启动，努力让一切回归正轨。

然而，衰老相关过程的复杂性远超想象，传统的研究方法难以窥其全貌。于是，系统级方法应运而生，它能深入分析基因电路的非线性动力学，与合成生物学携手，为我们揭示延长寿命策略的设计原则。在这场探索中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）凭借其与长寿相关的保守分子机制、易于基因操作和较短的世代时间，成为了理想的 “实验伙伴”，带领我们一步步揭开衰老的神秘面纱。

解析 GRNs：从数据到模型的探索之旅

要解读 GRNs 的调控关系，就如同解开一团错综复杂的线球，需要巧妙的方法和精准的工具。研究人员常常从收集数据开始，无论是新生成的，还是公开可用的批量或单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，都是宝贵的 “线头”。

以批量 RNA 测序为例，在对细胞进行扰动前后分别测序，再运用加权基因共表达网络分析（WGCNA），就像给基因进行 “聚类游戏”，依据共表达模式找出那些在扰动后差异表达的基因模块。这些模块接着被输入到通路分析算法，如基因集富集分析（GSEA）中，从而确定哪些生物学通路和过程被激活或抑制。

如果有 scRNA-seq 数据，SCENIC 和 SCENIC + 等工具就可以大显身手了。它们通过整合转录因子（TF）结合和靶基因相互作用信息，在异质样本中找出特定亚群的共表达模块，让我们看到不同细胞群体中基因调控的独特之处。像 Monocle 和 scVelo 这样的工具，则能推断基因表达轨迹，帮助我们理解细胞在分化过程中的动态变化。

当收集到足够的信息后，研究人员就开始构建模型。普通微分方程（ODEs）是常用的数学工具，它可以描述基因和蛋白质之间的相互作用动态。比如，通过 SCENIC + 鉴定出的关键转录因子，在 ODEs 模型中可以被设定为激活剂或抑制剂，其靶基因的表达水平则可以根据 Monocle 或 scVelo 的结果来推断。最后，利用 COPASI、PySB 等软件对模型进行模拟，或者采用随机框架如 StochPy 来捕捉细胞间基因表达的差异。为了让模型更加准确，研究人员还会通过单细胞成像技术，观察关键调控因子的动态变化，以此来优化模型，最终揭示细胞状态的稳定性等重要信息。

酵母衰老的基因密码：SIR2-HAP 回路的奥秘

在酵母的衰老研究中，复制衰老和时序衰老为我们提供了不同的研究视角。复制衰老就像是酵母细胞的 “分裂次数限制游戏”，指的是母细胞在停止分裂进入衰老前能产生子细胞的次数；而时序衰老则关注非分裂细胞的寿命，这对于理解像神经元这样的终末分化细胞的衰老很有帮助。本文主要聚焦于影响复制衰老的基因电路，探索其对有丝分裂细胞衰老的贡献。

过去的研究发现，基因相同的酵母细胞衰老时会走上两条不同的 “轨道”：一条是核糖体 DNA（rDNA）沉默丧失和核仁衰退的 “轨道 1”，另一条是血红素耗尽和线粒体衰退的 “轨道 2” 。这两条轨道的分歧由 sirtuin 2（SIR2）和血红素激活蛋白（HAP）的相互抑制回路控制。SIR2 作为一种赖氨酸脱乙酰酶，参与 rDNA 沉默，维持核仁稳定；HAP 则调控血红素生物合成和线粒体功能相关基因的表达。

数学模型揭示，SIR2 和 HAP 的相互抑制会在 SIR2-HAP 景观上产生多个稳定的固定点（或稳态）。每个单细胞的衰老过程，就像是朝着这些稳态的 “旅程”，走向低 SIR2 高 HAP 状态对应着 “轨道 1” 衰老，而走向低 HAP 状态则对应 “轨道 2” 衰老。

受此启发，研究人员尝试通过基因工程和合成生物学设计干预策略来延长寿命。比如，让 SIR2 过表达两倍，就会产生一种新的长寿衰老模式（“轨道 3”），细胞最终会处于 SIR2 和 HAP 水平适中的状态。进一步提高 HAP 水平，能稳定这个新的稳态，使酵母寿命延长约 60% 。还有研究将 SIR2-HAP 回路改造成负反馈回路，让 SIR2 和 HAP 水平产生持续振荡，结果酵母寿命大幅延长了 82%，这首次建立了基因网络结构与细胞寿命之间的因果联系。

除了基因操作，调节环境中的葡萄糖水平也能影响酵母衰老。研究发现，不同浓度的葡萄糖会以不同的剂量 - 反应关系调节 SIR2 和 HAP 的活性，从而影响细胞衰老的命运。0.1% 的葡萄糖能使 SIR2 和 HAP 在中间水平达到微妙的平衡，产生一个长寿稳定固定点，实现最佳的寿命延长效果。而且，理论和实验都表明，周期性振荡的葡萄糖水平也能延长酵母寿命，即使不产生长寿稳定固定点。这些发现为我们提供了通过调控基因和环境来延缓衰老的新思路。

长寿基因电路的通用设计原则：负反馈回路的关键作用

从众多研究中，我们可以总结出一个关于长寿基因电路的通用主题：衰老会让重要功能蛋白的水平偏离 “健康范围”，就像火车偏离轨道，导致细胞功能恶化，最终走向死亡。而围绕这些关键因素的基因电路，有的会加速这一过程，有的则能减缓它。其中，负反馈回路就像是火车的 “自动矫正器”，能动态对抗衰老的影响，是实现长寿的重要设计原则。在许多情况下，负反馈回路能让关键功能因子的水平产生振荡，使细胞围绕健康状态实现动态平衡。下面我们来看看几个包含内源性负反馈回路、具有潜在延长寿命功能的重要通路。

蛋白酶体反馈回路：细胞内的 “垃圾清理工”

蛋白质稳态的丧失是衰老的一个显著特征，与许多神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病密切相关。在衰老细胞中，受损或错误折叠的蛋白质会不断积累，就像垃圾在房间里越堆越多，最终导致细胞功能恶化。

蛋白酶体是细胞内的 “垃圾清理工”，它是一个多亚基的蛋白水解复合物，能够降解被小泛素肽标记的蛋白质，是清除衰老细胞中受损蛋白质的主要机制。在酵母中，蛋白酶体的丰度受到一个精妙的负反馈回路调节。RPN4 作为一个关键的转录激活因子，负责上调蛋白酶体基因的表达，但它同时也是活性蛋白酶体的降解目标，因此寿命极短。在正常生理条件下，这个反馈回路就像一个精准的天平，维持着蛋白酶体和受损蛋白质之间的平衡。当受损蛋白质增多时，它们会与 RPN4 竞争有限的蛋白酶体资源，导致 RPN4 降解减少，其蛋白水平升高，进而上调蛋白酶体的数量，清除多余的受损蛋白质。当受损蛋白质被清理干净后，RPN4 又会迅速被蛋白酶体降解，使蛋白酶体的数量回到基础水平。

然而，随着衰老的发生，蛋白酶体基因的转录能力下降，就像天平的平衡被打破。研究发现，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的衰老过程中，参与内质网（ER）中蛋白质稳态的基因，如伴侣蛋白 HSP4/BiP，常常下调。同时，热休克因子 1（HSF1）作为蛋白酶体基因的保守转录激活剂，其活性在多种组织和生物体中随年龄增长而下降。这些变化共同作用，使反馈系统失去平衡，导致蛋白酶体活性降低，蛋白质损伤不断积累，最终细胞走向死亡。

为了增强蛋白酶体反馈回路的弹性，研究人员提出了一些策略。比如，对 RPN4 和蛋白酶体基因的启动子进行工程改造，提高它们的转录能力，就像给天平加上更坚固的支架，使细胞对衰老相关的转录下降更具抵抗力。或者引入一个对衰老影响不太敏感的正交负反馈回路来驱动蛋白酶体基因的表达，从而维持蛋白质稳态，延缓衰老。

能量稳态回路：细胞的 “能量调节器”

代谢重编程与衰老紧密相连，调节能量摄入或代谢率对寿命有着显著影响。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）就是一个典型的例子，它与寿命呈负相关，删除酵母中的 TOR1 基因、抑制小鼠中 mTORC1 的活性，都能延长寿命。

在酵母中，不同的衰老轨迹伴随着不同的代谢变化。“轨道 1” 衰老时，细胞会从发酵代谢转变为呼吸代谢；“轨道 2” 衰老则表现为糖酵解增强、呼吸作用受抑制，这可能会导致细胞内 ATP 水平改变。而且，在各种生物体中，ATP 水平都会随着年龄增长而下降，这表明能量稳态的丧失是衰老的一个重要标志。

维持能量稳态就像在细胞内维持一个精准的能量 “收支平衡表”，需要 ATP 的产生和消耗保持平衡。AMP 激活蛋白激酶（AMPK）是细胞内的 “能量传感器”，在真核生物中高度保守。当细胞内 AMP/ATP 的比例升高，也就是 ATP 水平下降时，AMPK 就会被激活，它会像一个忙碌的 “调度员”，磷酸化代谢酶和转录因子，促进产生 ATP 的分解代谢途径，抑制消耗 ATP 的生物合成途径。当 ATP 水平恢复正常后，AMPK 又会失活。

在衰老早期，AMPK 通路还能有效地应对年龄引起的 ATP 变化，维持细胞的能量稳态。但随着衰老的进展，线粒体功能障碍导致 ATP 生成大幅减少，同时 AMPK 的反应性也随年龄下降。虽然具体机制还不完全清楚，但可能与蛋白质磷酸酶的表达或活性增加有关，这些磷酸酶会使 AMPK 失活。AMPK 敏感性的降低打破了 ATP 感知和生成之间的平衡，导致衰老细胞出现能量不足的问题。研究表明，增强 AMPK 的活性可以延缓衰老、延长寿命，而删除或抑制 AMPK 则会缩短寿命。

为了对抗衰老对能量稳态的影响，研究人员设想构建一个强大的负反馈回路来调节 AMPK 的表达。比如，在一个受 AMPK 抑制的启动子控制下，引入额外的 AMPK 基因拷贝。这样，AMPK 的表达就能根据其自身活性动态调整，弥补其在衰老细胞中反应性降低的问题，维持细胞的能量平衡。

p53 反馈回路：基因组的 “守护者”

p53（也称为 TP53）是 GRN 中应对 DNA 损伤的核心转录因子，被誉为基因组的 “守护者”。它的动态变化主要受其转录靶标 MDM2 的调节，两者形成一个负反馈回路。

当 DNA 出现双链断裂（DSB）时，就像基因组这座 “大厦” 出现了严重的 “裂缝”，MRN 复合物（包括 MRE11、RAD50 和 NBS1）会迅速识别断裂位点，并招募 ATM 蛋白到现场。ATM 被激活后，会磷酸化 p53，一方面抑制 MDM2 对 p53 的泛素化和降解，另一方面增强 p53 的稳定性和活性。p53 随后会促进数百个基因的转录，其中就包括编码 MDM2 的基因。MDM2 基因的启动子对 p53 脉冲持续时间非常敏感，一旦 p53 水平升高，MDM2 就会被大量转录，进而抑制 p53 的活性，使 p53 水平下降，形成一个循环，产生 p53 振荡现象。这种振荡就像基因组的 “巡逻兵”，能反复监测 DNA 的完整性，通过使细胞周期停滞在 G1 和 G2 期来修复受损 DNA，同时避免触发细胞凋亡或衰老的阈值。

p53 网络中既有负反馈机制防止 p53 过度激活，又有正反馈机制支持其在激活 DNA 损伤反应通路中的关键作用。因此，破坏 p53 网络中调节其活性的成员会对健康和寿命产生重大影响。超过一半的癌症类型都存在 TP53 基因的缺失或失活，缺失 Tp53 基因的小鼠和斑马鱼往往会患上各种肿瘤。相反，p53 过度活跃的突变，如 C 末端截断，会导致寿命显著缩短，并出现与衰老相关的特征。这就像 p53 有一个 “黄金平衡点”，其活性必须精确调节，太少会导致细胞不受控制地增殖和癌症发生，太多则会引发过多的细胞死亡和加速衰老。例如，一些削弱 p53 功能的小鼠模型，在不患肿瘤的情况下往往寿命更长。

MDM2 的生殖系突变会导致 p53 活性增加，从而引发早衰。比如，在表皮中特异性删除 Mdm2 会导致小鼠皮肤过早衰老。药物抑制 MDM2 可以减少人原代成纤维细胞中衰老细胞的活性，降低衰老相关分泌表型（SASP）因子的产生。在人类中，MDM2 的一种常见剪接变体 MDM2-a，能结合全长 MDM2，抑制 p53-MDM2 相互作用，导致寿命缩短约 20%。

当 p53 的负反馈减弱或正反馈增强时，p53 的动态变化可能会诱导细胞衰老。虽然衰老可以防止肿瘤形成，但 SASP 会带来有害影响。衰老细胞数量随着年龄增长而增加，它们分泌的各种因子会引发慢性炎症，导致多种慢性疾病和组织功能障碍。研究发现，抑制衰老细胞中 FOXO4 等维持衰老所必需的因子，可以使 p53 从细胞核释放到线粒体，触发细胞死亡。此外，调节衰老细胞与相邻细胞之间的通讯，抑制促炎细胞因子的分泌，也是一种潜在的干预策略，有望减轻衰老相关的炎症反应，延缓衰老进程。

总结与展望：衰老研究的未来之路

GRNs 就像一个精密的乐团，在应对各种刺激时演奏出协调的 “乐章”。但随着衰老的到来，这个乐团开始出现混乱，许多调控系统失灵。通过研究衰老过程中这些调控回路的崩溃，我们能够找到干预的 “关键点”，利用合成生物学等技术，有针对性地调节这些回路，为延长寿命提供可能。

衰老相关的负反馈回路通过 “推 - 拉” 机制维持细胞内环境的稳定，一旦它们失去弹性，衰老就会加速。无论是利用合成生物学技术，还是通过营养限制等方式，增强这些回路的稳健性，都能提高细胞对衰老相关损伤的抵抗力。而且，这些回路并不是孤立存在的，它们相互关联，一个通路的变化会影响其他通路，不仅在细胞内发挥作用，还会影响相邻细胞，甚至对整个生物体的衰老产生影响。

例如，造血干细胞（HSCs）在经历细胞内在衰老的同时，也会对机体的整体衰老产生系统性影响，包括免疫反应下降和 HSC 适应性改变。通过对 HSCs 进行基因改造，研究人员可以扰动这些系统，研究其对寿命的影响，这为研究衰老提供了一个可扩展的方法，将细胞层面的研究与整体系统联系起来。

然而，目前仍有许多问题等待解答。比如，不同的衰老相关 GRNs 与其他网络之间的相互作用是如何塑造独特的衰老轨迹的？负反馈回路在不同细胞类型中的弹性如何，哪些补偿通路在衰老过程中最先受损？组织内的细胞异质性对衰老有何贡献，针对特定细胞群体能否减缓或逆转组织衰老？对于寿命较长的生物体，如何整合单细胞技术来预测 GRNs 的动态活动及其在衰老过程中的最终崩溃？随着研究的不断深入，相信这些问题都将得到解答，为我们延缓衰老、促进健康长寿带来更多的希望。

Design principles of gene circuits for longevity