精准切割肺切片分泌肽组和蛋白质组研究新突破：SP3 工作流程展现强大效能

来自丹麦的研究人员为探究 PCLS 上清液肽组和蛋白质组，开发 SP3 工作流程，成果具有广泛应用潜力。

　　精准切割肺切片（PCLS）模型是一种体外组织系统，用于疾病建模和研究外源化合物的作用。然而，对 PCLS 和其他组织切片在组织培养过程中分泌的蛋白质（蛋白质组）和肽（肽组）的研究较少，尽管这些数据可能为组织切片的生物学特性及其所经历的变化提供关键信息。在本研究中，研究人员开发了一种工作流程，利用改良的单 - pot 固相增强样品制备（SP3）工作流程来检测 PCLS 上清液的肽组和蛋白质组。通过对合成肽构建体回收率的定量，将 SP3 工作流程与超滤进行了直接对比评估。结果显示，无论 SP3 中使用的有机溶剂是丙酮还是乙腈，也无论超滤的截留分子量是 2kDa 还是 10kDa，SP3 工作流程在回收小合成肽方面均优于超滤。所开发的 SP3 工作流程在分析不同条件下的 PCLS 上清液时能提供可靠的数据。该方法可在单个工作流程中，从单个样品中识别出大量从组织释放到上清液中的不同天然肽（489 种）和蛋白质（370 种）。因此，这种方法能够提供广泛而深入的肽组和蛋白质组数据，在分析培养组织样品的分泌组方面具有潜在的广泛适用性。

精准切割肺切片（PCLS）组织模型是一种先进的体外实验设置，旨在克服体内动物模型的复杂性，同时在可控的细胞培养环境中保留天然组织架构和细胞类型。该方法可减少动物个体间的差异，因为它允许从同一只动物身上获取多个组织样品（切片），从而减少实验动物的使用数量。这一模型已被用于多种研究，如急性损伤引起的毒理学效应、细胞外基质的变化、对呼吸道感染的反应、药物研发和验证筛选，以及健康组织与病变组织之间的差异研究等。该模型还能随时间评估组织功能和完整性，同时监测切片培养过程中分泌到细胞培养基（上清液）中的蛋白质和代谢物。

质谱（MS）是一种高灵敏度且用途广泛的技术，可对生物系统（包括 PCLS 模型）中存在或释放的肽（肽组）和蛋白质（蛋白质组）进行非靶向性的全面表征。在传统的基于质谱的 “自下而上” 蛋白质组学策略中，完整的蛋白质会被酶解成肽，以便于质谱分析。通过使用特异性明确的酶，蛋白水解肽可通过数据库搜索算法与蛋白质序列进行匹配。相比之下，“自上而下” 的蛋白质组学策略在省略蛋白水解消化步骤后，可用于分析内源性肽。对于被归类为 “肽组” 的肽并没有固定的界定标准，以前曾使用过如分子量小于 10kDa 和 / 或长度小于 100 个氨基酸等标准。肽组数据有助于了解分泌或释放的肽，以及细胞外蛋白重塑周转过程中通过蛋白水解或其他机制产生的片段。许多细胞外基质（ECM）中的肽具有生物活性，可作为受体配体、信号分子发挥作用，还有一些可作为生理或病理条件下组织的生物标志物。因此，一些蛋白水解肽不仅是蛋白质的标记物，还能激活或失活某些过程。

尽管人们对生物系统的肽组越来越感兴趣，但与经典的 “自下而上” 蛋白质组学相比，通过质谱对肽组进行表征仍处于有限的小众领域。这至少部分归因于基于质谱的肽组学所面临的分析挑战。此外，释放的肽和小蛋白质具有相似的物理化学性质，这使得设计从无法直接进行质谱分析的蛋白质中分离内源性肽的实验方案颇具挑战性。因此，需要仔细考虑样品处理和质谱分析的实验工作流程，以克服内源性肽（通常丰度较低）和天然蛋白质（通常丰度较高）之间浓度差异过大带来的问题。目前的实验方法包括通过超滤和固相萃取分离和提取肽。而且，由于缺乏定义蛋白水解肽的特定 N 端和 C 端边界，无法通过数据库搜索引擎进行识别，使得内源性肽的质谱分析变得困难。

本研究评估了使用不同截留分子量（MWCO）的超滤膜和采用不同溶剂的单 - pot 固相增强样品制备（SP3）方法，对提取、分离和富集内源性肽的效果。结果显示，SP3 方法的数据表现更优，随后研究人员采用改进后的工作流程，利用该方法检测 PCLS 上清液的肽组和蛋白质组。研究流程示意图如图 1 所示（此处省略图 1 相关内容）。

研究中使用的化学试剂和材料包括：购自 Sigma-Aldrich（丹麦索堡）的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、三（2 - 羧乙基）膦（TCEP）、2 - 氯乙酰胺（CAA）和尿素；购自 Promega（美国威斯康星州麦迪逊）的 LysC（质谱级）；购自 Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的 Alamar Blue 细胞活力试剂。储存蛋白质 / 肽样品时使用 Eppendorf（德国汉堡）的 LoBind 蛋白质管。实验还用到 Sera-Mag 磁性羧基修饰颗粒磁珠（1:1 ，此处 1:1 具体含义原文未详细说明，保留原文表述）。

研究人员利用一种源自 I、IV、V 和 VI 型胶原蛋白临床相关序列的合成肽混合物，代表具有不同疏水性和分子量的低丰度内源性肽。该肽混合物分别采用两种样品制备方法处理（如图 1 所示，此处省略图 1 相关内容）：一是在变性条件下进行超滤，随后分析滤液和截留液；二是采用 SP3 固相萃取法。

本研究展示了一种可靠且简单的工作流程，能够识别从肺组织切片释放到培养基上清液中的蛋白质和内源性肽。据研究人员所知，这是首次报道采用这种联合方法检测精准切割组织切片系统的分泌组。这种基于磁珠固相萃取的方法，能够检测到大量释放的肽和蛋白质。

作者贡献声明：Annika H. Hansen 负责撰写 - 评审与编辑、撰写 - 初稿、项目管理、方法学、调查研究、正式分析、数据整理、概念构思；Lasse G. Lorentzen 负责撰写 - 评审与编辑、监督、方法学、调查研究、正式分析、概念构思；Diana J. Leeming 负责撰写 - 评审与编辑、监督、资金获取、概念构思；Jannie M.B. Sand 负责撰写 - 评审与编辑、监督、项目管理、方法学。

本项目由丹麦研究基金会（为 Annika H. Hansen 提供博士奖学金）、诺和诺德基金会 - 哥本哈根大学 BRIDGE 项目（为 Lasse G. Lorentzen 提供奖学金）以及诺和诺德基金会（授予 MJD Laureate Continuation 研究资助 NNF20SA0064214）资助。

利益冲突声明：Annika H. Hansen、Diana J. Leeming、Jannie M.B. Sand 是 Nordic Bioscience 的员工。Jannie M.B. Sand 和 Diana J. Leeming 也是 Nordic Bioscience 的股东。MJD 声明与诺和诺德 A/S 签订了咨询合同，并且是初创公司 Seleno Therapeutics 的董事和大股东。这些资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、手稿撰写以及是否发表研究结果的决策过程中均未发挥作用。其他作者声明无利益冲突。