揭秘生物同手性起源：N - 磷酸化氨基酸的关键作用

本文发现 N - 磷酸化氨基酸（N-P-aa）可促进同手性肽形成，揭示其在生物同手性起源中的潜在作用。

　　

引言

在地球的现代生物大分子中，生物同手性是一个重要特征。在核糖体蛋白质合成过程中，L - 氨基酸起着核心作用，而 DNA、RNA 和纤维素则都是由 D - 碳水化合物构成。蛋白质的手性严格地以高立体选择性识别其底物，哪怕只有一个氨基酸残基通过翻译后修饰发生构象变化，都可能完全破坏蛋白质的正常生物学功能，进而导致生物体死亡或患病。不过，D - 氨基酸在生命活动中也有着重要意义，比如微生物会利用 D - 丙氨酸（D-Ala）作为细胞壁的重要成分，以抵抗蛋白酶的降解；内源性的 D - 丝氨酸（D-Ser）和 D - 天冬氨酸（D-Asp），能够直接与 N - 甲基 - D - 天冬氨酸型谷氨酸受体相互作用，具有重要的神经活性功能 。此外，利用 D - 氨基酸化学合成的许多镜像蛋白，像人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）蛋白酶、T7 RNA 聚合酶和胰蛋白酶等，在体外实验中都证实具有催化生物学功能，这表明在早期地球上，镜像同手性生物聚合物甚至镜像生命的存在是具有可行性的。

自米勒的火花放电实验开创性工作以来，人们已经在模拟前生物的条件下，合成出了多种外消旋的蛋白质原性 α- 氨基酸。然而，从手性单体构建模块的外消旋混合物出发进行化学偶联，通常会产生杂手性生物聚合物。在过去几十年里，科研人员通过开发化学和物理方法，利用对称破缺剂和手性放大技术，在高选择性的同手性聚合方面取得了不少进展，比如表面选择性吸附、手性脂质双层、圆偏振光、结晶、同手性丝氨酸八聚体的形成以及不对称自催化等。但生物大分子如何变得同手性，至今仍是一个未解之谜，而研究生物同手性的起源，对于探寻地球生命起源的潜在答案至关重要。从外消旋的 L - 和 D - 构建模块混合物出发，通过单体的对映选择性连接来构建同手性生物聚合物，这一过程是否可行，值得深入研究。

1953 年，Frank 提出了自发对称合成的数学模型，认为对映体可以催化自身的生成，并通过抑制相反构型对映体的形成来导致对映体过量（ee）。40 多年后，Soai 等人的出色工作首次展示了 Frank 提出的这一方案的实验实例，Soai 反应的产物可以二聚形成同手性二聚体，这些同手性二聚体比作为储库的杂手性二聚体更具活性，从而导致对称性破缺和 ee 的自催化放大。不过，Soai 反应形成的同手性二聚体与氨基酸和糖类等生物构建模块差异很大。因此，寻找在前生物一锅汤的混沌环境中，通过单一手性氨基酸连接形成同手性肽的前生物途径，具有重要的研究价值。最近，有研究探索了利用外消旋的 D，L - 酰胺腈和对映纯的氨基酸，进行前生物合成同手性蛋白质原性肽的可能途径，但该反应更倾向于形成杂手性二肽。尽管当反应物均为非外消旋和非对映纯形式时，这种酰胺键形成的杂手性偏好也能导致手性放大，但在合理的前生物条件下，探索 α- 氨基酸相同手性的对映选择性连接，对于前生物时期同手性 L - 肽的出现仍然极具研究意义。

磷酸在生命中的几乎所有生物过程中都占据着主导地位，其可逆的磷酸化过程对于生物系统中的能量和信息传递至关重要，这表明在早期化学演化过程中，磷酸化很可能就已经融入了前生物化学。前生物时期，磷的可用性可以通过形成反应性和可溶性形式来提高，比如二氨基磷酸酯、多磷酸盐和环状三聚偏磷酸（P₃m）等。在碱性水溶液中，蛋白质原性 α- 氨基酸能够与 P₃m 高效反应，形成 N - 磷酸化氨基酸（N-P-aa）。本研究团队一直致力于将 N-P-aa 作为一种化学模型，用于研究在前生物条件下寡肽和核酸的共同演化形成过程。在本研究中，为了揭示磷酸化在生物同手性起源中可能扮演的角色，研究人员设计了实验，探究 N-P-aa 与外消旋氨基酸在水中形成同手性肽的过程，最终发现 N-P-aa 可以通过依赖 pH 的连接反应，在分子内和分子间磷酰基转移的驱动下，生成同手性二肽。

结果

外消旋氨基酸的 N - 磷酸化形成同手性肽

研究人员首先合成了对映体形式的 N - 磷酸化蛋白质原性氨基酸，如 P-L-Ala 和 P-D-Ala，将其作为在水中自催化酰胺键形成的化学模型。按照理论推测，在 pH 为 3 的水溶液中，将外消旋的 P-D，L-Ala 与 D，L-Phe 以 1:1 的比例孵育，最多可以产生八种同手性和杂手性二肽异构体。利用反相高效液相色谱 - 质谱联用技术（HPLC-MS），理论上可以分离并鉴定出四组非对映异构二肽，但对映体二肽由于在色谱柱上的保留时间相同，难以直接区分。为了量化对映体的产率，研究人员引入了稳定同位素标记的 L-Phe（¹³C₉，¹⁵N 标记，?L-Phe），并与 D-Phe 在相同条件下进行孵育。在电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析中，?L-Phe（重）的质荷比 m/z 为 176.1133，D-Phe（轻）的质荷比 m/z 为 166.0862，二者之间有 10 Da 的质量差。这样一来，含有?L-Phe 残基的对映体二肽就会产生 10 Da 的质量增量，从而可以利用液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）结合稳定同位素标记，相对定量组合二肽异构体的产率。同时，研究人员还进行了对照实验，在相同反应条件下，将外消旋的 D，L-Ala 与 D-Phe/?L-Phe（1:1）反应，不过使用 1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）作为水中的酰胺缩合试剂。

通过对二肽的提取离子色谱（EIC）分析发现，在 N - 磷酸化和 EDC 活化外消旋氨基酸的两个对比反应中，八种二肽异构体的相对丰度有所不同。四组二肽对映体，即 L-Ala-?L-Phe 与 D-Ala-D-Phe、?L-Phe-L-Ala 与 D-Phe-D-Ala、D-Ala-?L-Phe 与 L-Ala-D-Phe、?L-Phe-D-Ala 与 D-Phe-L-Ala，分别在质荷比 m/z 247.1506 和 237.1234 处实现了基线分离。利用在四个保留时间处提取的质谱图中，稳定同位素标记的特征峰对的相对丰度，可以对二肽异构体的相对强度进行量化。值得注意的是，在 N - 磷酸化反应中，同手性二肽 L-Ala-L-Phe 和 D-Ala-D-Phe 的归一化产率最高，分别为 25.7% 和 22.7%；而在 EDC 活化反应中，这两种同手性二肽的归一化产率最低，分别仅为 2.6% 和 2.7%，并且杂手性二肽 L-Phe-D-Ala 和 D-Phe-L-Ala 的归一化产率最高，分别为 20.8% 和 20.0% 。N - 磷酸化活化生成的同手性二肽的相对总产率为 62.9%，显著高于 EDC 活化的同手性酰胺键偶联反应（29.4%）。此外，N - 磷酸化反应中，N 端为 Ala 残基的二肽相对总产率为 75.6%，而 EDC 活化反应中仅为 35.1%。而且，N - 磷酸化氨基酸的孵育反应在三次重复实验中的相对偏差较小，这表明通过 N - 磷酸化进行的肽连接反应比 EDC 活化反应更稳定。

为了研究酰胺键形成的手性选择性，研究人员计算了不同二肽异构体之间的非对映体过量（de；%）或对映体过量（ee；%）。结果显示，L-Ala-L-Phe 的形成比 L-Ala-D-Phe 更具优势，de（%）为 26.8%。同样的同手性选择性在 L-Phe-L-Ala、D-Ala-D-Phe 和 D-Phe-D-Ala 这几种二肽中也有体现，它们的 de（%）分别为 27.5%、29.3% 和 11.9%。然而，EDC 活化反应表现出杂手性选择性，杂手性肽的 de（%）高达 -71%。有趣的是，在 N - 磷酸化的外消旋反应中，同手性 L - 肽 L-Ala-L-Phe 和 L-Phe-L-Ala 的产率较高，ee（%）分别为 6.3% 和 3.9%。

N-P-aa 可选择性地与同手性氨基酸连接

为了进一步研究 N-P-aa 的同手性选择性，研究人员简化了外消旋反应，将 N - 磷酸化 L-Ala 与外消旋 D，L-Phe 以等摩尔比（1:1）在酸性和碱性条件下的水中进行孵育。首先，取两份等量的 N - 磷酸化 L-Ala（P-L-Ala，a），分别在 pH 为 3 和 11 的水中与外消旋 D，L-Phe 孵育。通过³¹P - 核磁共振（³¹P-NMR）堆叠分析发现，在 pH 为 3 的水中，P-L-Ala（a）会逐渐转化为四种主要产物（b、c、d 和 e），利用 H 耦合³¹P-NMR 进一步确认了 b - e 中含有磷原子的可能化学结构。而在 pH 为 11 的水中，P-L-Ala（a）在长达 13 天的孵育过程中都非常稳定。对 pH 为 3 时反应生成的二肽进行 HPLC-ESI-MS 分析，在质荷比 m/z 237.1234 处鉴定出四种二肽异构体，即 L-Ala-L-Phe、L-Ala-D-Phe、L-Phe-L-Ala 和 D-Phe-L-Ala，并通过标准品以及串联质谱分析进行了进一步确认，同时还利用标准品和串联质谱分析，确认了在质荷比 m/z 401.1836 处存在痕量的 N - 磷酸化二肽，而且在测试条件下，这些二肽异构体的 ESI-MS 检测灵敏度相似。

同手性二肽（包括 L-Ala-L-Phe 和 L-Phe-L-Ala）的总产率为 67.0%，其中，N 端为 Phe 残基的二肽总产率为 27.1%，可能是通过磷酰基转移的分子间活化产生的。研究结果还表明，二肽和 N - 磷酸化二肽的 de（%）受 P-L-Ala 与外消旋 D，L-Phe 摩尔比的影响较小。在三种摩尔比下，N 端为 Phe 残基的二肽的 de（%）都高于 N 端为 Ala 残基的二肽。同手性二肽 L-Ala-L-Phe（与 L-Ala-D-Phe 相比）和 L-Phe-L-Ala（与 D-Phe-L-Ala 相比）的平均 de（%）分别为 33.2% 和 50.1%，而令人惊讶的是，同手性 N - 磷酸化肽 P-L-Phe-L-Ala（与 P-D-Phe-L-Ala 相比）的 de（%）高达 97.5%。

研究人员还进一步研究了 N-P-Ala 在 pH 为 7 和 5 的水中的肽形成情况。³¹P-NMR 堆叠分析显示，N-P-Ala 与外消旋 Phe 在 pH 为 7 的水中孵育 144 小时后很稳定，而在 pH 为 5 的水中，孵育反应会逐渐被激活，产生几种含磷化合物。通过对不同时间点 N-P-Ala 的相对定量分析发现，P-L-Ala 的反应在水中对 pH 很敏感。LC-MS 分析表明，氨基酸的同手性连接有利于 L-Ala-L-Phe 的形成，在 pH 为 5 时其归一化产率最高，可达 52%。

为了探究 N - 磷酸酯基团的潜在影响，研究人员合成了二乙基磷酰基 - L-Ala（DEP-L-Ala），并在 pH 为 3 的水中与 D，L-Phe 反应，结果发现同手性二肽的相对总产率为 60.6%。随后，研究人员又合成了不含任何烷基的 N - 膦酰基 - L-Ala 钠盐，在 pH 为 3 的水中，它与外消旋 Phe 反应生成同手性二肽的相对总产率为 64.9%。这些结果表明，在同手性选择中起关键作用的是 N - 磷酸化，而不是酯基。综上所述，在酸性水溶液中，蛋白质原性氨基酸通过 N - 磷酸化和对映选择性连接，可以形成同手性二肽异构体。

N-P-aa 同手性连接的普遍性

在相同条件下，P-D-Ala 与外消旋 D，L-Phe 的连接反应结果，与 P-L-Ala 的反应结果非常相似。例如，在三种摩尔比下，同手性肽 D-Ala-D-Phe（与 D-Ala-L-Phe 相比）和 D-Phe-D-Ala（与 L-Phe-D-Ala 相比）的 de（%）分别在 34.8% - 39.9% 和 49.8% - 53.9% 的范围内。同样，P-L-Phe 和 P-D-Phe 分别与外消旋 D，L-Ala 的两个平行反应结果显示，随着 N-P-aa 与 D，L-Ala 摩尔比的增加，目标同手性二肽的 de（%）逐渐增大。例如，L-Phe-L-Ala（与 L-Phe-D-Ala 相比）和 L-Ala-L-Phe（与 D-Ala-L-Phe 相比）的 de（%）分别在 22.3% - 52.6% 和 30.9% - 44.3% 的范围内。有趣的是，在相同条件下，N-P-Ala 和 N-P-Phe 反应生成的 N 端为 Ala 残基的二肽异构体的总归一化产率均高于 70%，这表明 N-P-aa 可以作为磷酰基供体，对作为受体的氨基酸进行选择性分子间活化。此外，在 P-L-Phe 与 D，L-Ala 的反应中，形成了 de（%）高达 56.1% 的同手性 N - 磷酸化二肽；而在相同条件下，P-D-Phe 与 D，L-Ala 反应生成的 N - 磷酸化二肽表现出杂手性选择性，de（%）超过 -60%，这表明 N - 磷酰基可能在特定氨基酸的手性放大中起着关键作用。

为了研究通过 N - 磷酸化实现同手性连接的普遍性，研究人员将 P-L-Ala 与另外两种外消旋氨基酸 D，L-Ser 和 D，L-Met 在酸性条件下孵育。在利用反相柱进行 HPLC-MS 分析之前，先使用丹磺酰氯（DNS-Cl）对潜在的二肽异构体 Ala-Ser/Ser-Ala 和 Ala-Met/Met-Ala 进行标记，并通过标准品以及串联 ESI-MS 分析进行了确认。结果发现，同样形成了 de（%）在 18.6% - 52.2% 范围内的同手性二肽，这表明 N - 磷酸化诱导的其他蛋白质原性 α- 氨基酸连接的同手性选择性具有通用性。

磷酰基与羧基之间的协同效应

为了阐明 N 端磷酰基在同手性连接中的潜在作用，研究人员合成了两种 N 端胺基被保护的 L-Ala 衍生物，分别是带有 N - 叔丁氧羰基（Boc-）和 N - 乙酰基（Ac-）的 N - 羟基琥珀酰亚胺酯（NHS 酯），并分别在水中与外消旋 D，L-Phe 孵育。同时，还合成了 N - 磷酸化 L-Ala 的 N - 羟基琥珀酰亚胺酯（P-L-Ala-NHS），并在相同条件下与外消旋 D，L-Phe 进行对比孵育。所有 N 端保护的二肽都通过标准品和串联质谱分析进行了确认。结果发现，Ac-L-Ala-NHS 的反应表现出杂手性连接，de（%）为 -13.8%；而 Boc-L-Ala-NHS 和 P-L-Ala-NHS 的反应则表现出轻微的同手性选择，de（%）分别为 6.7% 和 10.2%。这些数据表明，N-P-aa 的 N 端磷酰基和 C 端羧基可以协同调节氨基酸的同手性连接。

此外，利用电子圆二色谱（ECD）分析发现，在 pH 为 8 和 3 的水中，P-D-Ala 和 P-L-Ala 都存在科顿效应。与在 pH 为 8 的碱性条件下相比，在 pH 为 3 的酸性条件下，ECD 光谱曲线发生了明显变化，信号发生了翻转。例如<在 ph 8 时，p-l-ala 记录到负的 ecd 信号，波长范围在 185 至 270nm ；而当 ph 调至 3 时，产生了强烈的正信号，这表明 p-l-ala 的分子构象会随着水中特定 ph 的变化而自动调节。然而，在酸性或碱性条件下，未保护的游离 l-ala 和 d-ala 在水中均未观察到这种依赖 ph 的构象变化。科顿效应是分子内部的一个关键特征，它比旋光性更能详细地反映不对称分子的光学特性。在酸性条件下，p-l-ala>

无水条件下五配位磷中间体的鉴定

有研究提出，五配位五元环磷中间体在 N - 磷酸化 α- 氨基酸的自组装肽形成过程中起着关键作用。为了确定五配位磷中间体在同手性连接中的潜在作用，研究人员在无水条件下原位合成了带有三甲基硅基保护的 N-P-aa，以稳定高反应性中间体。通过 31P-NMR 堆叠分析研究了 N-P-L-Ala 在无水苯中的反应过程。具体来说，先将邻苯撑磷酰氯（PPC）与 N,O - 双 (三甲基硅基)-L-Ala（DTMS-L-Ala）在无水苯中孵育 5 分钟，形成带有三甲基硅基保护的 N - 磷酸化 L-Ala（N-P-L-Ala），随后其转化形成五价 N - 磷酸化 L-Ala 中间体（P (V)-L-Ala） 。接着，加入外消旋的 DTMS-D，L-Phe 继续孵育，在约 - 46 ppm 处检测并确认了 Ala 和 Phe 的五配位磷中间体的两对 31P-NMR 信号，其比例为 69:31 。P (V)-L-Ala 的磷酰基发生分子间转移至 Phe，形成了新的 N - 磷酸化 D，L-Phe 五配位中间体（P (V)-D，L-Phe） 。最后，加入水迅速淬灭反应性中间体，形成两种磷酸。用水淬灭反应后，通过 HPLC-MS 分析样品，发现在无水条件下形成了同手性二肽 L-Ala-L-Phe 和 L-Phe-L-Ala，其 de（%）分别为 6.6% 和 10.9%。值得注意的是，在水性环境中形成的二肽的 de（%）大于在无水溶液中的情况，这表明水在氨基酸的同手性连接中也起着重要作用。

综上所述，研究人员提出了 N-P-aa 形成同手性肽的化学机制。五配位磷中间体可以通过两种可能的途径受到攻击，包括羰基和磷酰基，分别导致肽的形成以及通过氨基酸之间的分子间磷酰基转移形成新的五配位磷中间体。研究人员认为，N-P-aa 的五配位磷中间体在酸性条件下的同手性连接对映选择性中起着重要作用。因此，研究人员提出了一个关于生物同手性起源的、具有前生物合理性的化学模型。该化学模型表明，具有高能 P-N 键的 N-P-aa 可以为利用外消旋构建模块，以依赖 pH 的模式形成同手性肽提供一条途径，这使得在前生物时期促进如今蛋白质等同手性生物大分子的形成成为可能。

讨论

同手性对于控制生物聚合物（如蛋白质和核酸）的正确折叠结构和正常生物学功能至关重要。然而，通常认为前生物合成大分子的合理小构建模块以消旋混合物的形式存在。同手性的起源很可能与生命的起源同时发生，在手性对称破缺可能发生在使用外消旋单体的聚合过程中。本研究提出的化学模型表明，氨基酸的 N - 磷酸化可以显著增强在水中利用外消旋氨基酸进行同手性肽形成的对映选择性酰胺连接。这一发现有助于理解生物大分子形成的连接过程中生物同手性的起源，并且与理论模拟的概念结果一致，即偏手性可能在聚合物水平上建立。

α- 氨基酸的 N - 磷酸化，而非 β- 或 γ- 氨基酸，可在温和条件下通过羧基进行分子内自激活以实现肽连接。此外，磷酰基的分子间转移可以在温和条件下激活另一分子氨基酸以形成酰胺，从而产生具有多样结构的组合肽库，促进化学进化。N - 磷酸化有助于相同手性的氨基酸进行同手性连接，并且 N - 磷酸化 L - 氨基酸与 L - 氨基酸之间的对映选择性连接，比 N - 磷酸化 D - 氨基酸与 D - 氨基酸之间的连接更容易，这可能有利于前生物时期 L - 肽形成的对称破缺。研究还发现，氨基酸之间磷酰基的分子间转移具有结构和手性选择性，N-P-Ala 被确定为一种良好的潜在磷酰基供体，可以转移到其他氨基酸上。而且，N - 磷酸化二肽的同手性非常高，de（%）高达 97.5%，这表明磷酰基转移过程可以显著提高外消旋氨基酸的同手性选择性。最近，有研究观察到具有不同溶解度的磷酰胺对映体的高度对映选择性富集，本研究结果进一步丰富了 N - 磷酸化在手性选择中的多种作用。在本研究体系中也检测到了三肽，但与二肽产率相比，三肽的相对总产率不到 0.5% 。未来可以通过增加 N-P-Ala 与酸碱切换的反应循环，来提高寡肽的程度。最后，五配位磷中间体被证明是 N-P-aa 在水中同手性连接反应的关键结构。有趣的是，五价磷烷已被 X 射线晶体学确定为酶催化磷酰基转移反应中的稳定中间体。在酸性条件下，N-P-aa 依赖 pH 的构象变化对于调控其性质和化学稳定性至关重要，这为在前生物环境中具有 pH 梯度的化学进化早期阶段，同手性肽连接建立了一个合理的依赖 pH 的化学模型。

通常情况下，磷酸盐的溶解度较低，在自然环境中只能检测到极少量的磷酸根离子，这一固有局限性影响了土壤和水生态系统中磷的生物可利用性，使得科学家们曾认为磷酸基团不太可能在前生物环境中发挥作用。然而，近期发现磷酸盐在水中的溶解度出乎意料地高，这重新引发了人们对磷在生命起源中潜在作用的兴趣。在本研究中，研究人员揭示了前生物磷酸化在同手性肽形成中的关键功能，磷酰基的分子内活化和分子间转移可以协同调节氨基酸的手性连接，从而实现肽的同手性生成和放大。值得注意的是，在本研究的外消旋反应中，L - 肽的生成量较高，这为解释如今地球上蛋白质严格由 L - 氨基酸构成的现象提供了一些线索。总之，本实验提出了一个 N - 磷酸化的化学模型，有助于理解在前生物合理条件下外消旋氨基酸同手性连接的起源。

方法

有关材料合成和表征的完整详细信息，请参见补充方法。

资源可用性

如需进一步信息或资源请求，请联系通讯作者高翔（[e-mail]），他将负责处理和满足相关需求。本研究中使用的所有试剂，要么可从商业渠道购买，要么可以按照补充方法中的说明进行制备。支持本研究结果的数据可在文章及其补充信息中获取，如有需要，也可向相应作者索取额外数据。本文未报告原始代码。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：92256203、22274136 和 42388101）、中国国家重点研发计划（2020YFA0608300）、中国科学院空间应用工程与技术中心（项目编号：YYWT - 0901 - EXP - 16）、宁波市顶尖人才项目（项目编号：215 - 432094250）、福建省自然科学基金（项目编号：2023J01037）以及翔安生物医药实验室（项目编号：2023XAKJ0101004）的资助。

作者贡献

高翔、赵 Y 和张 Y 构思并设计了本研究。张 Y 进行了样品制备、合成以及 HPLC-MS/MS 分析。L.Z. 和 X.W. 协助进行了化学衍生化和 HPLC-MS/MS 分析。高翔和张 Y 对数据进行了分析。C.C. 协助绘制了部分图表。Y.L. 和 G.T. 提供了相关建议。高翔、张 Y 和赵 Y 撰写了本文。

利益声明

作者声明不存在利益冲突。