解析紧凑型 CRISPR-Cas9d 系统：解锁基因编辑新密码

为解决 Cas9d 在基因组编辑中作用机制不明及应用受限问题，天津医科大学等机构研究人员开展对 Cas9d 系统的研究。结果揭示其 PAM 识别等机制，发现 REM 模块等。这为开发高保真微型 CRISPR 工具奠定基础。

　　在基因编辑的 “舞台” 上，CRISPR-Cas9 系统无疑是一颗闪耀的明星，它就像一把精准的 “分子剪刀”，能够对基因进行精确编辑，为生物医学研究和疾病治疗带来了新的希望。然而，这把 “剪刀” 也存在一些问题。传统的 SpyCas9 虽然编辑效率高，但它的分子尺寸较大，受到腺相关病毒（AAV）载体有效载荷的限制，难以高效递送至细胞内发挥作用；同时，它还存在脱靶编辑的风险，就像射箭时偏离了目标，可能会对基因组的其他区域造成不必要的影响，这大大限制了其在临床治疗等方面的广泛应用 。

为了突破这些困境，寻找更理想的基因编辑工具，天津医科大学联合南方科技大学等机构的研究人员踏上了探索之旅，将目光聚焦在了 Cas9d 这一相对陌生但潜力巨大的 “选手” 身上。Cas9d 是 Cas9 家族中最小的成员，它具有独特的结构和潜在的高效编辑能力，有望成为解决当前基因编辑难题的 “金钥匙”。研究人员深入剖析 Cas9d 系统，试图揭开其神秘面纱，他们的研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员为了深入了解 Cas9d 系统，运用了多种关键技术方法。在结构解析方面，他们使用冷冻电镜技术（cryo-EM），这一技术就像一台超级显微镜，能够在接近天然状态下观察生物大分子的结构，从而分别解析出 Cas9d-sgRNA 复合物在无靶标和结合靶标状态下的结构。在功能验证上，通过体外靶 DNA 切割实验和大肠杆菌中的质粒清除实验，直观地检测 Cas9d 对 DNA 的切割活性，判断其是否能准确地 “剪断” 目标 DNA。

研究结果主要从以下几个方面展开：

1. Cas9d 系统的生化特性：研究人员将来自 Deltaproteobacteria 的 747 个氨基酸的 Cas9d 蛋白与 157-nt 的单导向 RNA（sgRNA）共表达，发现 Cas9d 与 CRISPR 阵列和适应机制 Cas1-Cas2 共定位，暗示它可能是一个活跃的防御系统。进一步研究表明，Cas9d 切割 DNA 靶标的活性具有剂量和时间依赖性，并且需要镁离子的参与。通过对其结构的预测和比对，发现它包含多个结构域，如桥螺旋（BH）结构域、靶标识别结构域（REC）等。对其核酸酶结构域中保守催化残基进行丙氨酸替代实验，揭示了 HNH 结构域在 PAM 上游三个核苷酸处切割靶链（TS），RuvC 结构域在 PAM 上游六个核苷酸处切割非靶链（NTS），产生具有三个核苷酸 5' 突出端的粘性末端 。
2. Cas9d 系统的冷冻电镜结构：借助冷冻电镜技术，研究人员获得了分辨率为 2.87 ? 的 Cas9d-sgRNA 核糖核蛋白（RNP）复合物结构，以及分辨率为 2.68 ? 的 Cas9d-sgRNA - 靶 DNA 三元复合物结构。在 RNP 复合物中，sgRNA 的大部分核苷酸都能被清晰解析，Cas9d 蛋白呈现典型的双叶结构。在结合靶 DNA 的状态下，形成了 22-bp 的异源双链，部分结构域的解析度得到提高，但也有部分结构域在不同状态下存在缺失或模糊的情况 。
3. PAM 识别的结构基础：Cas9d 识别并切割具有下游 NGG PAM 的双链 DNA 靶标。结构和生化分析表明，PAM 区域由 WED 和 PI 结构域共同容纳，与其他 Cas9 成员有所不同。WED 结构域中的 Asn651 和 Lys649、PI 结构域中的 Lys715 等关键氨基酸通过氢键与 PAM 区域相互作用，对靶标识别至关重要。此外，PI 结构域中的 Arg698 等氨基酸与 PAM 区域的磷酸骨架相互作用，稳定双链 DNA 靶标。对这些关键氨基酸进行突变后，发现会部分或完全消除靶标切割活性 。
4. sgRNA 的结构特征：Cas9d 的 sgRNA 由 22-nt 的引导序列和 135-nt 的 RNA 支架组成，与其他 II 型成员不同，它的 sgRNA 相对较长。其支架折叠形成复杂的三级结构，包括两个茎环和四个茎。其中，茎环 1 和茎 1 与其他 Cas9 的 sgRNA 有一定保守性，茎 2 和茎 3 与 REC 结构域存在广泛相互作用，可能为 Cas9d 提供额外的结构支持和功能协调，而茎 4 和茎环 2 与蛋白的相互作用相对有限 。
5. RNA 协调的靶标结合模块：研究发现，sgRNA 的茎 2 和茎 3 与 REC 结构域形成一个独特的功能模块 ——REM（RNA 协调的靶标结合模块）。REC 结构域由 REC1 和 REC2 组成，通过带正电的 REC 连接子相互连接。REC1 与茎 2、REC2 与茎 3 之间存在多种相互作用，如氢键、静电相互作用等，这些相互作用对 Cas9d 的切割活性至关重要。当结合靶 DNA 时，REC2 结构域和茎 3 会协同向外移动，而 REC1 - 茎 2 则保持相对刚性 。
6. 靶标结合时 REC 结构域和 sgRNA 的协同运动：通过比较无靶标和结合靶标状态下的结构，发现结合靶 DNA 时，REC2 结构域向外移动以容纳引导 - TS 异源双链，茎 3 也向外移动 6 ?。结构比较还表明，引导 - TS 之间至少需要 17 个碱基对才能触发 REC2 - 茎 3 的构象变化，这一结论在体外切割实验和体内质粒清除实验中得到验证。此外，REC1 结构域的 α3 螺旋与切割位点的 TS 存在冲突，删除该区域的 “盖子” 结构可略微增强靶 DNA 的切割效率 。
7. 引导 - 靶标异源双链的识别和切割保真度：引导 - TS 异源双链在远离 PAM 的四个碱基对处呈典型的 A - 型几何结构，其余 18 个碱基对由于与 Cas9d 的广泛接触而呈扭曲的 A - 型。Cas9d 通过 REC 结构域和 sgRNA 支架严格监测异源双链的互补性，对错配的耐受性较低，尤其是在 PAM 近端区域。与 SpyCas9 相比，Cas9d 在体外反应中表现出更高的保真度 。
8. REC 插入突变加速靶标切割：研究人员将 SpyCas9 的 REC2 结构域插入 Cas9d 的 REC 结构域，发现突变后的 Cas9d 切割活性增加，且不影响错配耐受性，这表明 REC 结构域的获得对 Cas9 的功能有积极影响 。

研究结论和讨论部分表明，Cas9d 系统采用蛋白质和 sgRNA 的混合结构来实现靶标结合，其相对较小的 REC 结构域和较长的 sgRNA 支架相互协作，形成了独特的 REM 模块，这一模块在靶标识别、核酸酶活性激活以及错配识别中发挥着关键作用。基于这些发现，研究人员对 Cas9d 系统进行了结构引导的工程改造，证明了 Cas9d 蛋白和 sgRNA 都可以进行一定程度的截断，同时保持核酸酶活性，并且通过突变 PAM 相互作用残基有望开发出 PAM 宽松的变体。此外，结构数据与进化见解相结合，为 Cas9d 的工程改造和基因组编辑工具的改进提供了重要指导，未来结合多种方法将进一步推动蛋白质工程和高效多功能基因组编辑工具的发展。这项研究为基因编辑领域带来了新的思路和方法，为攻克更多的生物学难题和疾病治疗提供了有力的支持 。