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为解析膜转运蛋白分子动力学难题，研究人员重组拟南芥 H+-ATP 酶，凝胶法成功制备含 AHA2 的 GUVs。
在微观的细胞世界里，膜转运蛋白就像一个个忙碌的 “运输小工”，它们控制着离子和分子跨越细胞膜的运输，对众多生物过程至关重要。其中，拟南芥 H
+-ATP 酶亚型 2（AHA2）作为 P3 型 ATP 酶家族的一员，更是肩负重任。它利用 ATP 水解产生的能量，将质子转运到细胞膜外，建立起质子电化学梯度。这一梯度不仅驱动着植物对养分的吸收、细胞内 pH 值的调节，还与气孔开闭、细胞生长等过程紧密相关。
然而，研究这些膜转运蛋白却困难重重。细胞环境极其复杂，就像一个庞大而混乱的 “大工厂”，各种物质相互干扰，使得研究人员难以精准地剖析膜转运蛋白的分子动力学机制。为了解开这一难题，在脂质体模型膜系统中重组膜转运蛋白成为了一种有效的研究策略。在这个 “人造小世界” 里，研究人员可以精确控制各种化学条件，深入研究膜转运蛋白的特性。
此次，来自德国鲁尔大学波鸿分校分子生物化学系以及丹麦哥本哈根大学植物与环境科学系的研究人员，针对 AHA2 在巨型单层囊泡（GUVs）中的重组条件展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为该领域的发展带来了新的突破。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是蛋白表达与纯化技术，他们将带有标签的 AHA2 在酵母中进行表达并纯化；其次是脂质体和 GUVs 的制备技术，通过不同方法制备各种脂质体和 GUVs；最后利用荧光标记和检测技术，标记 AHA2 并监测其质子泵活性。
在研究结果方面，研究人员首先探究了缓冲液条件和脂质对 AHA2 重组的影响。许多 GUV 形成方案都局限于低盐缓冲液和非带电脂质，但研究发现，特定阳离子和脂质组成会显著影响 P 型 ATP 酶的活性。实验表明，在重组过程中维持最低 K+浓度至关重要，降低 K+浓度会使 AHA2 蛋白脂质体的 ATP 驱动质子泵活性下降。同时，研究人员测试了不同脂质的影响，发现 1,2 - 二植烷酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸胆碱（DPhPC）会降低重组效率和质子泵活性，而阳离子脂质 1,2 - 二油酰 - 3 - 三甲基铵丙烷（DOTAP）在一定浓度范围内能成功整合 AHA2，但浓度过高时 AHA2 质子泵活性会消失。
接着，研究人员尝试了三种常见的将膜蛋白重组到 GUVs 中的方法。电形成法在实验中仅产生了少量含有 AHA2 的 GUVs，可能是因为蛋白脂质体内的离子干扰了 GUV 电形成所需的脱水过程，且实验中使用的频率可能也不利于 GUV 的生成，因此该方法不太适合进一步研究。电荷介导融合法中，AHA2 只是定位在膜上，并未成功融合进入 GUVs，即便添加了能促进融合的 1,2 - 二油酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺（DOPE），也未观察到融合现象，可能是缓冲液中的阴阳离子影响了融合过程。而凝胶辅助法显著增加了含有 AHA2 的 GUVs 数量，所有生成的 GUVs 都含有 AHA2。
最后，研究人员对凝胶辅助法生成的含 AHA2 的 GUVs 进行质子泵活性检测。他们利用腔内 pH 传感器吡喃（pyranine）来监测 GUVs 内的 pH 变化，以此判断 AHA2 的质子泵活性。实验结果显示，在添加 Mg-ATP 后，部分 GUVs 的荧光强度下降，表明 AHA2 在 GUVs 中具有 ATP 驱动的质子转运活性，但成功检测到质子泵活性的 GUVs 比例较低，可能是 GUV 形成过程中的脱水步骤影响了膜蛋白的活性。
在结论与讨论部分，研究表明生成含有 AHA2 的蛋白 GUVs 是一项需要平衡多种因素的任务，包括缓冲液条件、脂质组成等，这些因素既要保证蛋白的稳定性，又要满足 GUV 形成的要求。现有的 GUV 形成方案大多与 AHA2 在脂质体中发挥功能所需的钾离子浓度不兼容，某些脂质组成也会使 AHA2 失活，从而阻碍了通过电荷介导融合法制备蛋白 GUVs。在测试的方法中，只有凝胶辅助法能以足够的产量生成含有活性 AHA2 的 GUVs。这一成果为利用适合 GUVs 的技术详细表征 AHA2 提供了新平台，也为其他膜转运蛋白在 GUV 系统中保持活性的重组条件研究提供了有价值的参考框架，有助于推动膜转运蛋白领域的进一步发展。
