XFEL 晶体学揭示细胞色素 P450BM3催化非天然底物氧化的动态奥秘

研究人员利用 XFEL 技术研究细胞色素 P450BM3非天然底物氧化，揭示催化循环动态，助力生物催化剂设计。

　　

细胞色素 P450_BM3的探索之旅：解锁非天然底物氧化的秘密

在微观的生物世界里，酶就像一个个神奇的 “工匠”，有条不紊地催化着各种化学反应。细胞色素 P450（Cytochrome P450s，简称 P450s）家族便是其中一群至关重要的 “工匠”，它们是含血红素的氧化还原酶，参与从类固醇、脂质生物合成到异生物质降解等众多重要的生物学过程。

在这个大家族中，从巨大芽孢杆菌（Priestia megaterium）分离出来的 P450_BM3因其能高效催化长链脂肪酸的羟基化反应，拥有超高的周转频率（turnover frequencies，TOFs），成为了开发人工生物催化剂的热门选择。科研人员期望通过蛋白质工程方法，如定点突变和定向进化，对 P450_BM3进行改造，实现对非天然底物立体选择性氧化的精准控制。同时，一种利用假底物（decoy molecules，即比天然脂肪酸底物略小的底物模拟物）的化学方法也应运而生。当 P450_BM3误认并结合假底物时，活性位点会留下一个空腔，这个空腔就成为了非天然底物的反应空间。借助这种方法，科研人员成功地将 P450_BM3转变为一种多功能生物催化剂，使其能够氧化像气态烷烃甲烷这样氧化能垒高的非天然底物，还实现了苯乙烯的高对映选择性环氧化反应。

然而，在这场酶的改造盛宴中，仍有一些关键问题亟待解决。P450_BM3催化循环是一个复杂的过程，涉及多个阶段和独特的电子构型及氧化态变化。虽然科研人员对底物与 P450_BM3结合的结构动力学有了一定了解，但在催化循环后续步骤中，捕获完整的结构变化信息却困难重重。这主要是因为大多数催化中间体极不稳定，比如氧化中间体极易发生自氧化，形成无活性的氧化物种；而且血红素铁容易吸收 X 射线辐照产生的自由电子，改变自身氧化态，影响血红素的配位几何结构和结合配体，使得通过 X 射线晶体学确定 P450_BM3活性位点的真实结构受到极大阻碍。

为了攻克这些难题，来自日本兵库县立大学（University of Hyogo）、理化学研究所（RIKEN）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为我们揭示了 P450_BM3在非天然底物氧化过程中的奥秘，为生物催化剂的设计提供了重要的理论依据。

研究方法：开启微观世界的钥匙

研究人员采用了多种先进技术来探索 P450_BM3的奥秘。

1. 蛋白质变体构建：构建了 P450_BM3血红素结构域的两个变体 F393H 和 F87A/F393H，F393H 突变可稳定完全还原的酶和氧结合形式，而 F87A 突变则与苯乙烯环氧化的对映选择性相关。
2. 晶体制备与处理：制备了氧化态、还原态和氧结合态的 P450_BM3微晶。氧化态微晶通过与苯乙烯和 C7ProPhe 共结晶获得；还原态微晶由氧化态微晶在厌氧条件下用连二亚硫酸钠还原制备；氧结合态微晶则在有氧条件下由还原态微晶制备，过程中需严格控制温度以防止自氧化。
3. 光谱技术：运用 UV - 可见吸收光谱对不同状态的 P450_BM3进行分析，通过特征吸收峰确认血红素的氧化还原状态和结合配体情况。
4. X 射线自由电子激光（XFEL）晶体学：利用 XFEL 产生的飞秒级 X 射线脉冲，基于 “先衍射后破坏” 的原理，对 P450_BM3的微晶进行无损结构分析，获取高分辨率的晶体结构数据。同时，使用同步辐射晶体学对部分数据进行验证。

研究结果：微观世界的奇妙发现

1. P450_BM3的酶活性：研究人员考察了野生型（WT）、F393H 和 F87A/F393H 在有或无假底物（C7ProPhe）存在下对苯乙烯氧化的酶活性。结果显示，C7ProPhe 显著提高了 TOF，使环氧苯乙烷成为主要产物，且 WT 酶生成的 (R)- 对映体过量。F393H 的 TOF 约为 WT 的三分之一，而引入 F87A 突变后，F87A/F393H 的 TOF 大幅提高，甚至超过了 WT 酶，同时其 (R)- 对映选择性也显著提升，达到 83% ee，远超 WT 和 F393H。这表明 F393 突变对假底物的作用和 F87A 突变的对映选择性影响不大。
2. 氧化态的晶体结构：氧化态的 P450_BM3 F393H 和 F87A/F393H 微晶的 UV - 可见吸收光谱显示出特征性的 Soret 带位移和分裂，表明存在六配位和五配位的血红素混合物。在 F393H 的活性位点，苯乙烯呈现两种不同的取向，Phe87 的侧链也有两种构象；F87A/F393H 中，苯乙烯更靠近血红素，但电子密度表明其结合存在一定灵活性。此外，两种变体的整体结构相似，但 F-、G - 和 I - 螺旋存在显著差异，F87A/F393H 的底物进入通道保持开放，I - 螺旋呈不规则扭结状。
3. 还原态的晶体结构：还原态下，F393H 的整体结构未发生明显变化，而 F87A/F393H 的 F - 和 G - 螺旋向底物结合位点移动，I - 螺旋的扭结得到缓解，两种变体在氧化态下的主要结构差异在还原态下得到减轻。在 F87A/F393H 中，Wat2 和 Wat3 出现，苯乙烯的结合模式限制为两种取向。两种变体在还原态下血红素均为五配位，Wat1 不再存在。
4. 氧结合态的晶体结构：氧结合态的制备极具挑战性，研究人员建立了一套特殊的制备方法。UV - 可见吸收光谱显示出氧结合态的特征吸收峰，且在低温下稳定，未发生自氧化。氧结合态的整体结构与还原态相似，但 O₂结合对局部结构产生影响，导致 Wat2 消失。在 F393H 中，O₂推动 Phe87，使苯乙烯仅采用一种取向；而在 F87A/F393H 中，由于 O₂与苯乙烯苯基的接近，苯乙烯的取向受限，其乙烯基指向 O₂，与 F393H 中的情况相反。

研究结论与意义：照亮生物催化的新道路

这项研究成功克服了捕获 P450_BM3真实中间结构的困难，揭示了催化循环动力学如何控制 P450_BM3对非天然底物（苯乙烯）的结合。F87A 突变在血红素附近为苯乙烯提供了一个空间，使其能够采取更有利于氧化反应的取向，从而提高氧化反应活性和 (R)- 对映选择性。研究表明，催化循环过程中的结构动力学对酶活性和对映选择性起着决定性作用，氧化态的结构并不能准确反映酶的催化活性状态，尤其是底物在活性位点的定位。这一发现对于理解其他血红素酶以及参与异生物质代谢的 P450 酶具有重要的启示意义。

此外，该研究为 P450_BM3的蛋白质工程改造提供了结构基础，有助于设计出更高效、更具选择性的生物催化剂。同时，研究中使用的 XFEL 技术有望应用于其他类型的 P450 酶研究，为在原子分辨率下理解酶和底物的动力学提供了有力工具，将推动生物催化领域的进一步发展，为实现更绿色、高效的化学合成提供可能。