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为解决猪细胞类型分类局限问题，研究人员开展巴马香猪单细胞测序研究，获高质量数据集及潜在标记基因12
在生命科学的探索旅程中，猪作为一种重要的模式生物，对其进行深入研究意义非凡。随着转录组技术的不断进步，科研人员在猪的转录组层面研究取得了诸多成果，例如完成了跨多个物种的转录组基因注释，其中就涵盖了猪，这为猪的转录组研究打下了坚实基础。然而，传统的转录组方法，像批量 RNA 测序，虽然推动了人们对基因表达的认知，但却无法捕捉单细胞水平的细胞异质性。单细胞 RNA 测序技术的出现，为解决这一问题带来了曙光，它能深入探究细胞异质性，成为单细胞研究的关键工具。
巴马香猪由于在生理、解剖、营养、代谢以及疾病相关方面和人类极为相似，在人类疾病研究中应用广泛。但目前，单细胞测序技术在巴马香猪转录组研究中的应用还比较有限，尤其是在系统定义巴马香猪内脏组织独特标记基因方面，相关研究更是匮乏。基于此，四川农业大学的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《BMC Genomic Data》杂志上。
研究人员采用了单细胞和单细胞核测序技术，对巴马香猪的皮下脂肪、内脏脂肪、腰大肌、肝脏、脾脏、肺和肾脏这七种组织进行研究。在样本采集环节，研究选用了一只成年雌性纯种中国巴马香猪，在严格控制的实验室环境下饲养，按照标准禁食 12 小时后进行麻醉、屠宰，随后迅速采集各个组织样本。
在样本处理与测序阶段，对于用于单细胞 RNA 测序文库构建的组织（肝脏、脾脏、肺、肾脏），研究人员迅速将新鲜采集的组织置于冰上，并在 30 分钟内进行处理。通过特定的消化液对组织进行解离和消化，再经过细胞滤网过滤去除杂质、裂解红细胞，利用流式细胞仪检测细胞活力，只有细胞活力超过 80% 的样本才会进入后续测序分析流程。而对于单细胞核测序样本（内脏脂肪、皮下脂肪和腰大肌），则需先将组织进行精细解剖、清洗、速冻保存，使用时再进行解冻、切碎，置于特定的匀浆缓冲液中处理，经过多次离心、过滤等操作获取细胞核，用于后续文库构建。之后，样本被运送至诺禾致源公司，使用 10× Genomics Chromium 单细胞 3′基因表达解决方案构建 cDNA 文库并测序。
在数据分析过程中，研究人员使用 CellRanger 软件对原始测序数据进行质量控制和基因定量，利用 R 软件和 Seurat R 包进行下游分析，包括线粒体基因定量、数据质量控制、数据标准化、细胞聚类等操作。通过这些分析，研究人员鉴定出不同细胞簇之间的差异表达基因，并对细胞类型进行注释，还进一步预测了潜在的标记基因。同时，研究人员利用‘merge’函数和 Harmony 方法分别对单细胞和单细胞核数据集进行整合，有效消除了批次效应。
研究结果令人瞩目。在实验工作流程和初始数据质量方面，研究人员成功从巴马香猪的七种组织中获取了高质量的测序数据，数据覆盖度高、测序饱和度良好，为后续分析提供了坚实基础。在组织特异性细胞类型分类上，每种组织都呈现出独特的细胞类型，像皮下脂肪和内脏脂肪含有成纤维 / 脂肪祖细胞和脂肪细胞，腰大肌有骨骼肌纤维细胞等。在整合分析结果方面，无论是 scRNA-seq 数据还是 snRNA-seq 数据，经过整合分析后，不仅提升了数据质量，还发现了不同组织间的共性和差异，比如在 scRNA-seq 数据整合分析中，鉴定出了四个在所有四种组织中用于识别 T 细胞的标记基因。此外，研究人员还预测出了多个潜在的标记基因，这些基因在功能上与细胞类型的原始注释高度吻合。
总的来说，这项研究成果意义重大。研究人员获得了包含 72,710 个细胞的高质量数据集，为小型猪提供了全面的单细胞参考。这不仅有助于深入探究猪不同组织和器官之间的广泛异质性，还为识别巴马香猪独特的潜在生物标志物提供了宝贵资源。不过，该研究也存在一定的局限性，比如缺乏重复样本，研究仅基于巴马香猪的单细胞转录组数据，潜在标记基因还需进一步实验验证。未来的研究可以考虑增加重复样本，整合不同猪品种的数据，进一步验证这些潜在标记基因，从而推动相关领域的发展。
