CREB1/CRTC2 调控的外泌体 miR-93-3p：草酸钙致肾损伤的关键 “推手”

为探究外泌体介导的上皮 - 巨噬细胞通讯在草酸钙（CaOx）诱导肾损伤中的作用，研究发现 CaOx 晶体通过特定信号通路加重肾间质损伤，为治疗提供新靶点。

　　在泌尿系统疾病的研究领域中，肾结石一直是一个不容忽视的 “顽固分子”。流行病学研究显示，中国肾结石的发病率在 1.0 - 5.0%，并且呈上升趋势。其中，草酸钙（CaOx）结石约占肾结石的 80%。当 CaOx 晶体在肾脏 “安营扎寨”，就会引发一系列问题。它会对肾小管上皮细胞产生细胞毒性，通过线粒体功能障碍、活性氧（ROS）生成增加、溶酶体损伤和炎性小体激活等方式，导致细胞受损。受损细胞释放的细胞因子又会加剧肾脏炎症，甚至可能引发急性肾损伤，还会加速 CaOx 晶体在肾脏的沉积。

在这个过程中，巨噬细胞会被招募到晶体沉积部位。它们本是身体的 “免疫卫士”，具有吞噬和消化异物的功能，还能通过分化为不同表型来调节免疫反应。然而，长期暴露于 CaOx 会促使巨噬细胞向促炎的 M1 表型极化，分泌如白细胞介素 6（IL-6）、干扰素 γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）等促炎细胞因子，促进炎症级联反应，反而有利于结石形成。此外，巨噬细胞还能产生一种由颗粒蛋白和 DNA 组成的网络结构 —— 巨噬细胞胞外陷阱（METs），虽然它在抗感染免疫中发挥重要作用，但在肾结石形成和肾损伤中的作用却尚不明确。

近年来，外泌体作为细胞间通讯的重要 “信使”，引起了科研人员的关注。外泌体是一种由多泡体与质膜融合释放的纳米级囊泡（30 - 120nm），可以运输生物活性物质，如细胞因子、微小 RNA（miRNA）、膜受体等，参与免疫调节、组织损伤等多种病理生理过程。此前研究发现，CaOx 刺激的肾上皮外泌体可通过 miRNA 转移驱动 M1 巨噬细胞极化，但具体的分子机制尚不清楚。

为了深入探究这一机制，武汉大学人民医院泌尿外科的研究人员开展了一系列研究。他们的研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上，为草酸钙诱导的肾损伤机制研究提供了新的视角，也为临床干预提供了潜在的治疗靶点。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展此项研究。在样本来源上，使用了武汉大学人民医院肾结石患者的肾脏组织及肾积水患者手术切除的非功能肾作为人体样本；动物实验则选用了雄性 C57BL/6 小鼠和 Rab27a 基因敲除小鼠。实验技术方面，主要包括以下几种：一是通过 miRNA 测序筛选差异表达的 miRNA，以确定潜在的关键分子；二是运用 RNA 测序（RNA-seq）分析巨噬细胞的基因表达变化，探索相关信号通路；三是采用双荧光素酶报告基因实验、蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、免疫荧光染色、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链式反应（CHIP-qPCR）等多种实验技术，来探究分子间的调控关系及相关机制。

研究结果主要如下：

1. 巨噬细胞浸润与外泌体分泌增加：研究人员通过给小鼠喂食维生素 D 补充的高钙饮食，成功建立了肾结石小鼠模型。在该模型中，小鼠的血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、尿钙和草酸水平显著升高，肾脏组织出现明显的损伤和晶体沉积。同时，研究发现肾结石小鼠和患者的肾脏组织中，巨噬细胞浸润显著增加，且以促炎的 M1 巨噬细胞为主。此外，肾结石小鼠和患者肾脏近端小管分泌的细胞外囊泡（EVs）也明显增加，其中 Rab27a 基因表达上调，提示其可能在肾结石的病理生理过程中发挥重要作用。
2. CaOx 刺激的外泌体促进 M1 极化：研究人员用 CaOx 刺激 TCMK-1 细胞，收集其分泌的外泌体（CaOx-exo），并与 RAW264.7 巨噬细胞共培养。结果发现，CaOx-exo 能显著促进巨噬细胞向 M1 表型极化，使其分泌更多的促炎细胞因子，如 IL-6、IL-8 和 TNF-α，同时减少抗炎细胞因子 IL-10 的分泌。而使用外泌体分泌抑制剂 GW4869 处理后，M1 极化现象明显减弱。在体内实验中，构建的 Rab27a 基因敲除小鼠表现出较少的 M1 极化，进一步证实了外泌体在促进 M1 极化中的作用。
3. 外泌体 miR-93-3p 靶向 NFAT5 的潜在机制：通过对 Ctrl-exo 和 CaOx-exo 进行 miRNA 测序，研究人员筛选出了多个差异表达的 miRNA，经过一系列筛选和验证，最终确定 miR-93-3p 是促进 M1 极化的关键 miRNA。生物信息学分析和实验验证表明，miR-93-3p 直接靶向巨噬细胞中的 NFAT5 基因。在 CaOx-exo 处理的巨噬细胞中，NFAT5 表达下调，而抑制 miR-93-3p 则能部分逆转这一现象，并减轻肾脏损伤。
4. NIK/NF-κB₂通路的作用：RNA 测序结果显示，NIK/NF-κB₂通路在巨噬细胞中显著激活。进一步研究发现，miR-93-3p 和 NIK 均为抑制 NF-κB₂通路的关键调节因子。CaOx-exo 刺激巨噬细胞后，miR-93-3p 表达上调，抑制 NFAT5 表达，进而激活 NIK/NF-κB₂通路，促进 M1 极化和 METs 形成。使用 miR-93-3p 抑制剂或 NIK 抑制剂处理后，可显著减轻炎症反应和肾脏损伤。
5. NFAT5 对 NIK/NF-κB₂通路的调控机制：研究人员通过 STRING 数据库分析，发现 NFAT5 可能通过 Akt1 调节 NIK/NF-κB₂通路。实验结果表明，NFAT5 能促进 Akt1 磷酸化，激活 cIAP1/2，进而使 NIK 发生泛素化降解，抑制 NF-κB₂通路。而当 NFAT5 表达下调时，NIK 逃脱泛素化降解，导致 NF-κB₂通路激活，加速肾脏损伤。
6. 体内实验验证：在体内实验中，研究人员通过尾静脉注射 CaOx-exo 或 Ctrl-exo 到肾结石小鼠模型中，发现 CaOx-exo 能显著加重肾脏损伤，且促进肾脏对外泌体的摄取。过表达 NFAT5 或注射 miR-93-3p 反义寡核苷酸（antagomir）可减轻 M1 极化、METs 形成和 NIK/NF-κB₂通路激活，减少肾脏损伤和结石形成。
7. M1 极化与 METs 形成的正反馈循环：使用 METs 抑制剂 CI-amidine 或 NIK 抑制剂 NIK SMI1 处理小鼠，可显著减轻肾脏病理变化，包括肾小管腔扩张、晶体沉积、M1 极化和 METs 形成。同时，激活细胞外陷阱的离子霉素（Ionomycin）可促进 METs 形成和 M1 极化，而 CI-amidine 和 NIK SMI1 能有效抑制这些效应，表明促炎巨噬细胞和 METs 相互促进，形成正反馈循环，加剧肾脏损伤。
8. miR-93-3p 的转录调控：研究人员通过公共在线数据库 TransmiR 筛选，发现 CREB1/CRTC2 转录因子复合物可特异性调控 miR-93-3p 的表达。CHIP-seq 和 CHIP-qPCR 等实验表明，CRTC2 在 CaOx 刺激下，通过与 CREB1 结合，特异性地结合到 miR-93 宿主基因（miR-93 HG）的启动子区域，促进 miR-93-3p 的转录。

研究结论和讨论部分指出，CaOx 晶体通过 CREB1/CRTC2 - 外泌体 miR-93-3p - NIK/NF-κB₂信号通路，促进 M1 巨噬细胞极化和 METs 形成，加重肾间质损伤。这一发现为理解 CaOx 诱导的肾损伤发病机制提供了重要依据，也为临床干预提供了潜在的治疗靶点。然而，研究也存在一定局限性，如未对其他外泌体货物（如 lncRNAs、mRNAs、支架蛋白等）进行系统探索。未来，随着纳米生物技术的不断发展，有望为肾结石和肾损伤的精准诊断和治疗开辟新的道路。例如，表面工程纳米颗粒可实现结石调节药物的靶向释放，纳米技术还可用于结石成分分析和肾脏损伤的动态监测。总的来说，该研究为深入了解草酸钙致肾损伤的机制奠定了坚实基础，具有重要的理论和临床意义。