增强抗胰蛋白酶变体对血浆激肽释放酶的特异性：噬菌体展示与部分回复突变的新突破

为治疗遗传性血管性水肿（HAE），研究人员通过噬菌体展示筛选 AATM358R变体，发现 7-FLEPS-3 对血浆激肽释放酶（Pka）抑制更优。

　　遗传性血管性水肿（Hereditary Angioedema，HAE）是一种令人困扰的常染色体显性遗传病，患者会反复出现急性肿胀，严重影响生活质量。HAE 主要分为三种类型，其中大部分与 C1 - 酯酶抑制剂（C1INH）的缺陷有关。C1INH 作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin），在调节补体、凝血和炎症途径中起着关键作用，它能够抑制多种蛋白酶，尤其是活化的血浆激肽释放酶（Plasma kallikrein，Pka）。Pka 就像一个 “小恶魔”，它能催化高分子量激肽原的裂解，释放出缓激肽，而缓激肽会导致血管扩张和通透性增加，引发炎症反应。

目前，虽然 C1INH 浓缩物替代疗法是治疗 HAE 的一种有效手段，但 C1INH 存在明显的局限性。它对多种蛋白酶的广谱抑制作用，使得其在抑制 Pka 时不够精准，而且抑制速度相对较慢，平均二级速率常数（k2?）仅约为 2.55×104M?1s?1 。此外，现有的用于控制 Pka 的药物也存在各种问题，有些药物半衰期短，不适合预防性给药；而新的预防性药物成本又很高。

在这样的背景下，来自加拿大麦克马斯特大学（McMaster University）和加拿大血液服务中心（Canadian Blood Services）的研究人员决心探索新的治疗方法。他们将目光聚焦在 α-1 抗胰蛋白酶（Alpha-1 Antitrypsin，AAT）上。AAT 是血浆中含量最丰富的 serpin，正常情况下主要抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，但当 AAT 的反应中心环（Reactive center loop，RCL）的 P1 位置发生 M358R 突变后，它的抑制目标就会发生改变，开始抑制多种凝血和接触系统蛋白酶，包括 Pka。

研究人员开展了一系列研究，旨在提高 AAT_M358R对 Pka 的特异性，使其成为治疗 HAE 的潜在新型治疗剂。相关研究成果发表在《BMC Biotechnology》上。

为了实现这一目标，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是噬菌体展示技术（phage display），他们构建了两个 AAT_M358R的噬菌体展示文库，分别在 RCL 的 P7 - P3 和 P2 - P3' 位置进行随机化，然后用 Pka 对文库进行迭代筛选。接着，对筛选出的变体进行表达、纯化和动力学表征，通过测定抑制 Pka 和凝血因子 XIa（FXIa）的二级速率常数（k2?）以及抑制化学计量（Stoichiometry of inhibition，SI）来评估变体的性能。此外，还利用了蛋白质建模技术，借助 PyMOL Molecular Graphics System 2.5 和 ClusPro 2.0 对 AAT_M358R变体与 Pka/FXIa 的相互作用进行建模分析。

研究结果如下：

• 噬菌体展示筛选及变体表征：经过五轮生物淘选，确定了最丰富的 Pka 抑制基序。P7 - P3 位置的基序为 QLIPS，P2 - P3' 位置的基序为 VRRAY。表达并纯化了携带这些基序的 AAT 变体，如 7 - QLIPS - 3 和 2 - VRRAY - 3'。对这些变体的动力学分析表明，7 - QLIPS - 3 对 Pka 的抑制速度比 AAT_M358R快 2.2 倍，且选择性提高了 9.2 倍；2 - VRRAY - 3' 虽然抑制 Pka 的速度较慢，但选择性也有所增加。
• 回复突变及组合突变研究：对 7 - QLIPS - 3 和 2 - VRRAY - 3' 进行回复突变，产生了多个回复突变体，并构建了组合变体 7 - QLIPSVRRAY - 3'。研究发现，7 - QLIPS - 3 的回复突变体中，7 - FLEPS - 3 对 Pka 的抑制效果最佳，其抑制速度比 AAT_M358R快 4.5 倍，选择性提高了 9.2 倍，且 SI 没有显著增加。而组合变体 7 - QLIPSVRRAY - 3' 在抑制 Pka 和 FXIa 方面表现不佳，未进一步研究。
• 分子建模分析：通过分子建模，研究人员发现 AAT_M358R变体与 Pka/FXIa 相互作用时，RCL 与蛋白酶之间的距离与抑制活性相关。例如，7 - FLEPS - 3 与 Pka 的距离缩短，抑制速度加快；而 2 - VRRAY - 3' 及部分回复突变体与 Pka/FXIa 的距离增加，抑制速度减慢。

研究结论和讨论部分指出，7 - FLEPS - 3 作为 AAT_M358R的变体，具有成为治疗 HAE 的潜在药物的潜力。它对 Pka 的抑制速度比现有治疗药物 C1INH 快得多，为 HAE 的治疗提供了新的希望。然而，研究也发现，噬菌体展示筛选出的 RCL 基序在实际应用中存在一些不确定性，如在噬菌体表面和可溶性蛋白环境中的行为差异等。此外，虽然分子建模为理解变体的抑制活性提供了一定的依据，但仍存在局限性。

总的来说，这项研究通过噬菌体展示和部分回复突变技术，成功筛选出对 Pka 具有更高特异性和抑制活性的 AAT_M358R变体，为 HAE 的治疗开辟了新的方向，有望为患者带来更有效的治疗方案。