革新免疫接种：mRNA 疫苗技术与应用的全面回顾

mRNA 疫苗是现代疫苗学的变革性平台，本文全面剖析其技术、应用、挑战与前景。

　　

mRNA 疫苗：疫苗学的新曙光

在医学领域，疫苗一直是预防和控制传染病的关键武器。从早期的减毒活疫苗、灭活疫苗，到如今的亚单位疫苗，疫苗技术不断发展。然而，传统疫苗在应对突发疫情时存在诸多局限，如研发周期长、成本高、对新病原体反应迟缓等。mRNA 疫苗的出现，为疫苗领域带来了新的希望。

mRNA 疫苗的概念早在 20 世纪 70 年代就已提出，但直到 90 年代才得到证实。它是一种基于核酸的疫苗，通过将编码抗原的 mRNA 导入细胞，在细胞质中翻译为抗原蛋白，从而激发机体的免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA 疫苗具有独特优势：其一，研发周期短，传统流感疫苗通常需要 6 - 8 个月的生产时间，而 mRNA 疫苗在识别病原体序列后不到一年即可获批紧急使用；其二，安全性高，mRNA 不具有感染性，且不会整合到宿主 DNA 中；其三，生产过程可快速、规模化且成本效益高，它在无细胞系统中生产，减少了潜在的污染风险；其四，能够编码多种抗原，增强对高抗性病原体的免疫反应。

mRNA 疫苗的结构与设计

mRNA 疫苗的结构与真核生物 mRNA 相似，由 5' 帽、3' 聚腺苷酸（poly (A)）尾、开放阅读框（ORF）以及两侧的非翻译区（5'UTR 和 3'UTR）组成。这些结构在疫苗的稳定性、翻译效率和免疫原性方面发挥着关键作用。

1. 5' 帽结构：5' 帽是一种化学修饰帽，可促进核糖体在翻译过程中的结合，增强 mRNA 的稳定性。常见的帽结构有 Cap 0 和 Cap 1，Cap 1 结构因在核糖 2'-O 位置甲基化，能更有效地促进蛋白质翻译、逃避先天免疫识别，还可进一步修饰为 Cap 2 结构，对 mRNA 稳定性和翻译效率产生显著影响。目前，添加 5' 帽的方法主要有两步多酶反应和共转录法，共转录法如 CleanCap AG 技术结合 T7 RNA 聚合酶，能在 mRNA 合成过程中直接引入帽结构，效率更高，可产生高浓度且高比例 Cap 1 结构的 mRNA。

2. 非翻译区结构：5'UTR 和 3'UTR 在蛋白质表达中起重要作用。5'UTR 主要促进翻译起始，其长度、序列和二级结构会影响 mRNA 翻译效率，通常选择来自高表达人类基因的序列，如 α - 珠蛋白或 β - 珠蛋白基因。3'UTR 则影响 mRNA 的稳定性和半衰期，长度一般在 130 - 280 核苷酸，同样可选用人类 α - 珠蛋白或 β - 珠蛋白基因序列，例如，在 mRNA 疫苗构建中，HA 基因的 3'-UTR 包含两个重复的人类 β - 珠蛋白（2hBg）可提高 mRNA 稳定性和蛋白质产量。

3. 开放阅读框：ORF 是 mRNA 疫苗免疫原性和翻译效率的关键决定因素。对编码目标抗原的序列进行优化，包括密码子优化、调整鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）含量等，可促进蛋白质折叠和翻译效率调节。同时，引入修饰核苷酸如 N1 - 甲基假尿苷（N1m? - UTP）和 5 - 甲基胞苷，能提高翻译效率，增强疫苗的有效性和安全性，还可减少先天免疫识别。此外，添加信号肽可引导合成蛋白的定位，增强抗原呈递效率。

4. Poly (A) 尾：Poly (A) 尾由 10 - 250 个腺嘌呤核糖核苷酸单位组成，能确保 mRNA 的有效翻译和稳定性，有助于 mRNA 向细胞质的转运，并参与形成翻译活性核糖核蛋白（RNP）。其长度可调节 mRNA 翻译效率、稳定性和蛋白质表达，至少 30 - 40 个腺苷才能有效抑制 mRNA 的降解途径。在实际应用中，如 mRNA - 1273（Moderna）携带由 100 个腺苷组成的均匀 Poly (A) 尾，而 BNT162b2 mRNA 疫苗（Pfizer - BioNTech）采用了含有特定连接序列的分段 Poly (A) 尾。

mRNA 疫苗的递送系统

mRNA 疫苗分子较大且带负电荷，易被细胞外核糖核酸酶（RNases）降解，因此需要有效的递送系统将其导入细胞。脂质纳米颗粒（LNPs）是目前最常用且已获批用于人类的递送系统。

1. 脂质纳米颗粒：LNPs 由阳离子脂质、可离子化脂质、胆固醇和聚乙二醇（PEG） - 脂质等关键成分组成，形成稳定高效的递送系统。它能保护 mRNA 免受酶降解，延长疫苗在体内的循环时间，促进细胞摄取，将 mRNA 精准递送至靶组织，尤其是抗原呈递细胞（APCs）。阳离子脂质作为第一代用于 mRNA 递送的脂质，通过与带负电荷的 mRNA 形成稳定复合物发挥作用；可离子化脂质则能在细胞内环境中促进 mRNA 从内体逃逸，确保其有效释放到细胞质中进行翻译。

2. 其他递送系统：除 LNPs 外，还有多种新兴的 mRNA 递送系统正在研发中。聚合物纳米颗粒由天然或合成聚合物组成，通过静电相互作用与 mRNA 结合，形成保护屏障，如聚（d - l - 丙交酯 - co - 乙交酯）（PLGA）、聚（氨基酸）（PAAs）等。脂质 - 聚合物 hybrids 结合了聚合物的稳定性和脂质的生物相容性，能增强细胞摄取并降低毒性；外泌体作为天然的细胞外囊泡，可在最小化免疫激活的情况下运输 mRNA；基于肽的载体利用细胞穿透肽（CPPs）实现高效的细胞内递送和内体逃逸；无机纳米颗粒如金和二氧化硅纳米颗粒具有高稳定性和功能化潜力，可靶向特定细胞类型。

mRNA 疫苗的作用机制：细胞摄取与抗原产生

mRNA 疫苗的免疫机制始于 mRNA - LNP 复合物的内吞作用，随后通过内体逃逸进入细胞质。肌肉注射后，mRNA 可转染肌肉细胞和组织驻留的 APCs，如树突状细胞和巨噬细胞。在细胞质中，mRNA 被核糖体翻译为目标抗原。部分合成的抗原被转运至 APCs 表面，呈递给 B 淋巴细胞，使其分化为浆细胞，产生针对抗原的抗体；另一部分抗原则分泌到细胞外空间，被其他 APCs 摄取并在吞噬溶酶体中降解，随后通过主要组织相容性复合体 II 类（MHC II）分子呈现在细胞表面。同时，部分合成的抗原在 APCs 内被蛋白酶体降解为肽段，与 MHC I 类分子结合并呈现在细胞表面，激活细胞毒性 T 细胞，从而引发体液免疫和细胞免疫反应。

mRNA 疫苗的制造过程

mRNA 疫苗的制造主要包括上游生产、下游纯化和制剂三个阶段。

1. 上游生产：通过体外转录反应（IVT），利用携带感兴趣基因的重组质粒生成 mRNA 转录本。IVT 反应需要 RNA 聚合酶、无机焦磷酸酶（IPP）、Cap 2'-O - 甲基转移酶等多种酶，以及核苷酸、镁离子缓冲液和 RNase 抑制剂。此外，可使用 CleanCap Reagent AG 进行共转录添加 5' 帽。

2. 下游纯化：IVT 反应产生的 mRNA 含有多种杂质，如残留的 NTPs、酶、错误形成的 mRNA、双链 RNA（dsRNA）和 DNA 质粒模板等，需要进行多步纯化。实验室规模的纯化方法包括 DNA 酶 1 消化去除 DNA，然后用氯化锂（LiCl）沉淀，但这种方法无法完全去除 dsRNA 和截断的 RNA 片段。大规模生产中，常用的纯化方法包括尺寸排阻色谱（SEC）、离子对反相色谱（IPC）、纤维素基色谱柱、离子交换色谱（IEC）和基于亲和的分离等。然而，这些方法各有优缺点，如 SEC 无法去除 dsRNA，IPC 使用有毒试剂且成本高，基于亲和的分离存在结合容量低和成本效益低等问题。目前，切向流过滤作为一种快速有效的大规模生产方法逐渐受到关注。

3. 制剂：纯化后的 mRNA 需要与递送系统（如 LNPs）混合形成最终的疫苗制剂。在制剂过程中，需要优化各种参数，如脂质成分、mRNA 与脂质的比例等，以确保疫苗的稳定性和有效性。

mRNA 疫苗在对抗病毒病原体方面的创新进展

mRNA 疫苗在应对多种病毒病原体方面展现出巨大潜力，尤其是在 COVID - 19、流感和登革热等疾病的预防和治疗中取得了显著成果。

1. COVID - 19：mRNA 疫苗在 COVID - 19 大流行期间取得了巨大成功，如 Pfizer - BioNTech 的 BNT162b2 和 Moderna 的 mRNA - 1273 疫苗，它们通过针对 SARS - CoV - 2 的刺突（S）蛋白，激发了强大的体液免疫和细胞免疫反应，有效预防了严重 COVID - 19 疾病。然而，随着病毒变异，疫苗的有效性受到挑战，中和抗体水平在接种后 6 个月出现下降，对奥密克戎等变异株的中和能力减弱。为解决这一问题，研发了二价、多价 mRNA - LNP 疫苗，如 Delta/BA.5 mRNA 疫苗、三价（WT + BA.5 + XBB1.5）、五价（WT + BA.5 + XBB1.5 + BQ1.1 + CH1.1）和八价（WT + BA.5 + XBB1.5 + BQ1.1 + CH1.1 + Alpha + Delta + BA.2）疫苗等，这些疫苗能针对多种变异株提供更广泛的保护。

2. 流感：mRNA 疫苗平台在流感疫苗研发中也展现出广阔前景。目前主要采用两种方法开发通用流感 mRNA 疫苗：一种是使用组合抗原，如包含来自 20 种不同亚型抗原的联合核苷修饰 mRNA 流感疫苗；另一种是使用保守抗原，如针对流感病毒保守内部蛋白（核蛋白 NP、基质蛋白 1 M1 和聚合酶基本蛋白 1 PB1）的疫苗。这些疫苗在小鼠和雪貂模型中均显示出强大的免疫原性，能够中和多种流感病毒株，为预防季节性流感和潜在的流感大流行提供了新的策略。

3. 登革热：登革热是一种广泛传播的虫媒病毒疾病，目前的减毒活疫苗存在疗效不稳定等问题。mRNA 疫苗研究为登革热疫苗的开发带来了新希望。研究人员开发了针对不同登革热病毒血清型的 mRNA 疫苗，如针对 DENV - 2 的 mRNA 疫苗，携带 prME、E80 或 NS - 1 mRNA，在小鼠模型中显示出良好的免疫原性，能够诱导高水平的中和抗体和抗原特异性 T 细胞反应，为开发四价登革热 mRNA 疫苗奠定了基础。

mRNA 疫苗面临的挑战、未来机遇与展望

尽管 mRNA 疫苗取得了显著进展，但仍面临一些挑战，同时也蕴含着许多未来的机遇。

1. 提高疫苗效力：部分 mRNA 疫苗存在抗体反应不佳的问题，需要探索创新方法来增强其效力。例如，整合包膜病毒样颗粒（eVLP）技术，通过工程化 SARS - CoV - 2 刺突细胞质尾，招募 ESCRT 相关蛋白形成 eVLPs，可显著提高免疫原性，为开发下一代 mRNA 疫苗提供了新途径。

2. 免疫信息学与疫苗开发：传统疫苗开发依赖经验方法，而免疫信息学的出现为疫苗设计带来了新的变革。通过计算工具和结构生物学，能够更精准地预测抗原性、优化表位设计，开发出针对多种病毒病原体的多表位 mRNA 疫苗。例如，利用免疫信息学方法设计的针对猴痘、天花和牛痘病毒的多表位 mRNA 疫苗，在计算机模拟中显示出良好的免疫原性。

3. 多表位疫苗设计：目前大多数 mRNA 疫苗基于完整蛋白质，限制了更多蛋白质的整合，影响免疫原性且增加生产成本。多表位疫苗则利用来自不同病毒基因的免疫原性区域，创建表位镶嵌体，能够引发更广泛、持久的免疫反应，有效应对抗原漂移和变异。例如，设计的通用流感多表位 mRNA 疫苗，通过连接子连接不同表位，可增强疫苗的覆盖范围。

4. 罕见不良反应：mRNA - LNP 疫苗可能引发免疫相关的不良反应，如过敏反应和自身免疫反应。其中，PEG 作为 LNP 的关键成分，可能是潜在的过敏原，引发过敏反应和类过敏反应，如补体激活相关的类过敏反应（CARPA）。此外，广泛暴露于 PEG 可能导致个体产生抗 PEG 抗体，增加过敏反应的风险。尽管如此，mRNA 疫苗的整体益处远大于风险，相关研究正在深入开展以更好地理解和减轻这些不良反应。

5. AI 驱动的脂质设计：在 LNP 递送系统中，离子 izable 脂质的设计至关重要，但传统实验方法耗时耗力。计算机辅助设计（CAD）和人工智能（AI）的应用为离子 izable 脂质的开发带来了新突破。AI 驱动的工具能够快速评估和预测脂质候选物的性能，优化脂质库，加速创新，提高 LNP 制剂的可扩展性和精确性，推动下一代 mRNA 疫苗和疗法的发展。

6. 存储与冷链管理：大多数 FDA 批准的 mRNA 疫苗需要在低温（ - 20°C）或超低温（ - 80°C）下储存，这给疫苗的分发带来了挑战，尤其是在资源有限的地区。为解决这一问题，冻干技术成为一种有前景的策略。例如，Moderna 的冻干巨细胞病毒（CMV）mRNA 疫苗（mRNA - 1647）在 5°C 下可保存长达 18 个月，在室温下也能保持稳定。此外，自我扩增 mRNA（saRNAs）和环状 mRNA（circRNAs）也具有提高 mRNA 稳定性和效率的潜力，saRNAs 可降低剂量、提高生产效率，circRNAs 具有高度稳定性，能够在室温下长期储存。

7. mRNA 纯化与质量控制：mRNA 的纯化和质量控制是确保疫苗有效性、稳定性和安全性的关键步骤。IVT 反应后的 mRNA 产品含有多种杂质，可能影响疫苗性能，需要采用先进的纯化技术，如高效液相色谱（HPLC）、酶处理和多模式色谱等，以去除杂质，提高 mRNA 的纯度和翻译效率，满足监管标准，为 mRNA 疫苗技术的进一步发展奠定基础。

结论

mRNA 疫苗技术作为免疫学和疫苗学领域的重大突破，具有强大的免疫激发能力、对新兴病原体的快速适应性和可扩展的制造工艺。在脂质纳米颗粒等递送系统的助力下，mRNA 疫苗的性能得到显著提升，应用范围不断扩大。尽管目前仍面临一些挑战，但随着技术的不断创新和研究的深入，mRNA 疫苗有望在全球公共卫生领域发挥更加重要的作用，为预防和控制传染病提供更有效的手段，推动医学领域的进一步发展。