新型诱导系统助力毕赤酵母基因编辑与生产 “双赢”

研究人员开发 TetR/tetO2 诱导系统调节毕赤酵母 HR，提升基因编辑效率且不影响生产。

　　在毕赤酵母（Pichia pastoris）中构建了一种可诱导的 CRISPR-Cas9 基因编辑策略，该策略在基因组整合中展现出优异的同源重组（HR）效率。这种诱导系统可将单基因和多基因的基因组整合阳性率提高至 80%，且不会影响以甲醇为碳源的细胞生长或脂肪酸醇的生产；此外，持续增强 HR 会显著损害脂肪酸醇的生物合成。

目前，CRISPR-Cas9 基因编辑工具已在非常规酵母中成功应用，增强 HR 修复途径可能是提高基因编辑效率的可行策略。然而，增强 HR 也会影响细胞代谢和生产生物合成，这些影响在大规模生产中会被放大。因此，迫切需要协调基因编辑效率和化学品生产。在本研究中，尽管诱导型 HR 系统仅在毕赤酵母中进行，并在摇瓶发酵条件下对脂肪酸醇生产进行了评估，但还应在更大规模的生物制造系统（如生物反应器）中对其他产品进行评估。因此，目前这项技术的技术就绪水平（TRL）介于 4 到 5 之间。

亮点：

• 在毕赤酵母中构建并优化了四环素阻遏蛋白（TetR）/tet_O2 诱导系统。
• TetR/tet_O2 诱导系统动态增强同源重组（HR），用于多基因的精确编辑。
• 动态增强 HR 不会损害细胞生长或产物生物合成。

摘要：甲醇营养型酵母毕赤酵母（Pichia pastoris，也称为 Komagataella pastoris）是生产蛋白质和天然产物的理想宿主。增强同源重组（HR）有助于提高基因组编辑的精度，但会给细胞适应性带来压力，不利于工业应用。为了克服这些挑战，研究人员开发了一种四环素阻遏蛋白（TetR）/tet_O2 诱导系统，用于动态调节毕赤酵母中与 HR 相关的基因 RAD52。这种方法将单基因缺失的阳性率显著提高到 81%。此外，内源性 MUS81-MMS4 的诱导过表达导致了多基因的高效（81%）基因组组装。这种诱导系统对不同培养基中的细胞生长没有不利影响，并且与持续过表达 HR 相关基因的菌株相比，从甲醇中产生的脂肪酸醇更多。研究人员预计，这种诱导调节适用于在不损害细胞适应性的情况下，增强毕赤酵母和其他非常规微生物中的 HR，以实现精确的基因组编辑。