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本文聚焦肺泡巨噬细胞（AM）内体 - 溶酶体系统与 SARS-CoV-2 复制关系，探索潜在治疗策略。
### 1. 引言
SARS-CoV-2 是引发 “2019 冠状病毒病”（COVID-19）大流行的病原体。尽管 2023 年 5 月 WHO 不再将 COVID-19 列为全球卫生紧急事件，但新变种的不断出现，如 SARS-CoV-2 盐析变种 BA.2.86，其刺突蛋白积累了 30 多个氨基酸突变，给全球公共卫生带来持续威胁。而且，部分康复患者会出现长期症状，即 “长新冠”，疫苗也因病毒变种的出现无法完全终结疫情，因此研发更有效的抗病毒药物和策略迫在眉睫。
目前的抗病毒药物主要通过靶向抑制病毒关键功能来阻断感染，像 MolnupiravirTM和 PaxlovidTM ，但这些药物存在需要反复优化升级、成本和可及性等问题。于是，一种新策略是通过阻断更普遍的细胞系统功能来阻止病毒传播。
巨噬细胞在宿主防御中发挥着重要作用，可清除衰老或凋亡细胞、病原体等。肺泡巨噬细胞（AM）作为肺部的主要免疫细胞，能吞噬病原体并调节免疫反应。在 COVID-19 进展过程中，AM 功能失调起着关键作用。同时，内体 - 溶酶体系统参与细胞内物质的内化、回收、处理和清除，研究发现 SARS-CoV-2 感染会导致内体 - 溶酶体系统功能改变，促进病毒复制和释放，因此基于增强 AM 内体 - 溶酶体系统降解 SARS-CoV-2 能力的抗病毒方法值得深入研究。
2. SARS-CoV-2 感染引发 AM 反应
SARS-CoV-2 主要通过鼻腔进入人体，常感染下呼吸道的肺泡，入侵 I 型和 II 型肺细胞以及 AM。AM 本应吞噬和消化外来病原体，但 SARS-CoV-2 感染会触发肺部组织的先天性免疫炎症，由促炎巨噬细胞介导。这些细胞还会释放细胞因子和趋化因子，引发适应性免疫反应，可能导致功能失调的免疫反应和细胞因子释放综合征，如巨噬细胞活化综合征或 “细胞因子风暴”，进而引发呼吸窘迫和多器官衰竭。
巨噬细胞有两种不同表型，即极化巨噬细胞（M1）和交替活化巨噬细胞（M2） ，在肺泡中存在肺泡 M1（AM1）和肺泡 M2（AM2） ，它们在宿主对抗呼吸道病原体中发挥不同作用。在 COVID-19 患者中，AM1 吸引免疫细胞到肺部组织，而 AM2 释放抗炎细胞因子并清除感染。研究表明，AM2 能有效清除 SARS-CoV-2 并限制其传播，而 AM1 常被病毒劫持，因其环境特征支持病毒复制和传播。
例如，基于人类多能干细胞衍生模型的实验显示，AM1 细胞诱导的抗病毒免疫反应会导致更大的肺细胞损伤和更多炎症因子分泌，包括 IL-6、TNF、CCL2、CCL3 和 CXCL10 ，而非活化的巨噬细胞（AM0）在病毒感染后也会表达关键炎症分子。相比之下，AM2 通过吞噬作用和产生 IL-10 信号通路相关的抗炎因子，保护肺细胞免受病毒感染并减轻肺部炎症。同时，AM1 抑制肺细胞生长并增强受损细胞凋亡，而 AM2 的抗炎表型在 ARDS 的增殖和纤维化阶段，支持炎症介质和程序性细胞死亡配体的产生。
不同患者的免疫反应模式和 AM1/AM2 比例不同，这在一定程度上解释了 COVID-19 易感性和症状的差异。一些基础疾病，如高血压、糖尿病，与较高的 AM1/AM2 比例相关，是严重 COVID-19 的已知风险因素，而与 AM2 活化相关的疾病，如过敏性哮喘，则不太可能导致严重 COVID-19。
3. AM 内体 - 溶酶体系统在 SARS-CoV-2 复制中的作用
内体 - 溶酶体系统由溶酶体和内体组成，是哺乳动物细胞的主要酸性细胞器，包含早期内体、回收内体、晚期内体和溶酶体等动态相互转化的细胞内膜隔室。这些细胞器通过质子泵维持低内部 pH，早期内体 pH 约为 6.5，晚期内体和溶酶体 pH 在 4 - 5 的酸性范围内。溶酶体含有 50 多种水解蛋白酶，在酸性条件下发挥最佳功能，内体则负责内化和分选物质，然后由溶酶体降解。冠状病毒的细胞进入、复制和子代病毒释放都依赖于内体 - 溶酶体途径的功能。
SARS-CoV-2 是一种正链单链 RNA 病毒，由含病毒 RNA 的内核衣壳和外膜上的刺突（S）蛋白组成。其感染周期包括附着和膜融合、病毒 RNA 释放、开放阅读框（ORF）和非结构蛋白的翻译、双膜囊泡形成、基因组转录和复制以及病毒粒子释放等步骤。
SARS-CoV-2 感染巨噬细胞时，与巨噬细胞结合触发细胞活化，通过内吞途径进入内体 - 溶酶体系统，而非依赖 ACE2 的机制。溶酶体中的组织蛋白酶 L（CTSL）在低 pH 环境下切割病毒 S 蛋白，促进病毒基因组 RNA 释放到细胞质中进行复制。然而，SARS-CoV-2 会劫持晚期内体 - 溶酶体途径，通过使溶酶体途径功能失调，降低溶酶体蛋白酶活性，阻止病毒降解，促进完整感染性病毒粒子从细胞中释放。
巨噬细胞可通过内体 - 溶酶体降解直接消除病毒，但 SARS-CoV-2 进化出多种策略逃避、操纵或阻断宿主细胞的自噬机制，如病毒 ORF3a 蛋白可阻断自噬体 - 溶酶体融合。
正常生理条件下，AM 更倾向于 AM2 样表型。AM2 具有较高的内体 pH 和较低的溶酶体 pH，较高的内体 pH 抑制 CTSL 酶活性，阻碍病毒细胞质 RNA 释放，而较低的溶酶体 pH 则能防止病毒劫持溶酶体，支持酸性溶酶体酶对病毒的降解。相比之下，AM1 具有更酸性的内体和更高的 CTSL 表达，有利于病毒 RNA 释放，但较高的溶酶体 pH 抑制病毒降解。而且，AM1 对 SARS-CoV-2 的内吞 / 吞噬效率比 AM2 更高。因此，AM1 促进 SARS-CoV-2 感染，而 AM2 则发挥相反作用。不过，AM2 释放的病毒 RNA 抗原可能诱导促炎细胞因子释放，促使 AM 向 AM1 样表型极化，当肺泡病毒载量超过一定阈值时，可能导致 AM2 表型重置，增加病毒载量，引发功能失调的免疫反应，损害宿主组织。所以，AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体病毒降解功能对控制 SARS-CoV-2 感染至关重要。
4. 调节 AM 内体 - 溶酶体系统抑制 SARS-CoV-2 复制
有效清除病毒颗粒对 COVID-19 患者的治疗至关重要。巨噬细胞等先天免疫细胞是抵御病毒感染的第一道防线，通过模式识别受体感知病毒病原体相关分子模式（PAMP），激活炎症途径和免疫反应来消除病毒。AM 在个体出生后就存在，在宿主对抗病毒感染中发挥重要作用，尤其是在 SARS-CoV-2 感染时，AM 是最早接触病毒的免疫细胞，其反应影响宿主 COVID-19 的结局。
由于 AM 内体 - 溶酶体系统在 SARS-CoV-2 复制和传播中起关键作用，调节内体 - 溶酶体功能或增强 AM 溶酶体降解能力可能会减少病毒复制。将 AM 从促炎的 AM1 表型重置为抗炎的 AM2 表型是对抗 COVID-19 的一种有前景的方法，因为 AM2 具有更强的抗病毒作用。与 AM2 相比，AM1 的内体 pH 较低，溶酶体 pH 较高，更有利于 SARS-CoV-2 复制和逃避溶酶体降解。因此，迫切需要安全有效的药物来降低 AM1/AM2 比例、增加内体 pH、降低溶酶体 pH 并促进溶酶体生物发生，以抑制 SARS-CoV-2 的复制和传播。
5. 探索生物分子通过调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体生物发生的潜在抗 SARS-CoV-2 作用
近期研究表明，溶酶体 pH 和生物发生的失调显著影响 SARS-CoV-2 复制。下面将聚焦于识别通过调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体生物发生发挥潜在抗 SARS-CoV-2 作用的生物分子。
5.1 巴氟霉素 A1 和氯化铵调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 的潜在抗 SARS-CoV-2 作用
巴氟霉素 A1 是一种大环内酯类抗生素，可抑制内体 V-ATPase，阻止质子进入内体 - 溶酶体腔，从而抑制内体 - 溶酶体酸化；氯化铵（NH4Cl）也具有中和内体 / 溶酶体 pH 的功能。理论上，它们既能通过降低内体 CTSL 活性抑制病毒 RNA 释放，又会因降低溶酶体病毒降解能力而减弱病毒清除。研究发现，巴氟霉素 A1 和 NH4Cl 在体外细胞模型和 hACE2 转基因小鼠体内对 SARS-CoV-2 具有抗病毒作用，且能防止巨噬细胞内体、溶酶体和吞噬体酸化，因此值得进一步研究其抑制 SARS-CoV-2 感染 AM 的作用。
5.2 调节转录因子 EB 介导的 AM 溶酶体生物发生的生物分子的潜在抗 SARS-CoV-2 作用
转录因子 EB（TFEB）是自噬和溶酶体生物发生的关键转录调节因子，可驱动自噬和溶酶体基因表达，增加溶酶体数量和活性，促进自噬体形成和吞噬体 - 溶酶体融合。TFEB 的活性主要受磷酸化调控，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）磷酸化 TFEB 后，使其与 14-3-3 蛋白结合并保留在细胞质中失活。
一些生物分子可调节 TFEB 活性，如白藜芦醇能激活 TFEB 和蛋白磷酸酶 2A（PP2A），使 TFEB 去磷酸化并转移到细胞核内，增加其表达；姜黄素的类似物 C1 可直接结合 TFEB 并激活它。研究报道，这些 TFEB 激活剂能有效抑制 AM 中的 SARS-CoV-2 复制，显示出作为 COVID-19 治疗药物的潜力。
5.3 溶酶体促渗化合物通过调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体生物发生的潜在抗 SARS-CoV-2 作用
溶酶体促渗化合物是一类能选择性积累在内体 / 溶酶体中发挥药理作用的小分子。一些具有碱性 pH 特征的溶酶体促渗分子可增加内体 - 溶酶体 pH，酸性特征的则降低其 pH。此外，某些溶酶体促渗化合物的内体 - 溶酶体摄取可诱导内体 / 溶酶体应激反应，升高腔内 pH，还能激活 TFEB，抑制 mTORC1 活性。因此，溶酶体促渗化合物可能通过调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体生物发生发挥抗 SARS-CoV-2 作用，但需要评估其改变 AM 溶酶体 pH、增加内体 pH 和增强溶酶体生物发生的能力，以及对内体 - 溶酶体系统复杂的调节作用。
5.4 氯喹和羟氯喹调节 AM 内体 - 溶酶体 pH 和溶酶体生物发生的双重抗 SARS-CoV-2 作用
氯喹（CQ）和羟氯喹（HCQ）是 FDA 批准的弱碱性药物，属于喹啉衍生物，能在细胞内酸性区室积累，细胞内浓度比细胞外高约 100 倍。研究表明，CQ 处理可增加溶酶体 pH，却意外降低 AM 内体 pH。从理论上讲，这对抑制 SARS-CoV-2 在 AM 中的 RNA 释放没有作用，但可促进溶酶体对病毒的降解过程。
另一方面，CQ/HCQ 可通过抑制 mTOR 活性，激活 TFEB 并使其核转位，逆转溶酶体功能障碍，发挥抗 SARS-CoV-2 作用。然而，有研究显示 CQ 可能使 AM 向 AM1 表型极化，促进 SARS-CoV-2 感染。由于这些矛盾的结果，CQ/HCQ 用于治疗 COVID-19 引发了争议，其疗效有限且可能产生副作用。其他一些溶酶体促渗碱性化合物，如 ROC-325、硝唑尼特、IITZ-01、IITZ-02 和甲磺酸奥巴克拉，可升高溶酶体 pH，但它们对 AM 内体 / 溶酶体 pH 和 TFEB 活性的调节作用尚不清楚，有待进一步研究。
6. 纳米颗粒改变 AM 内体 - 溶酶体系统功能抑制 SARS-CoV-2 复制的潜力
纳米颗粒在药物领域应用广泛，可影响巨噬细胞内体 / 溶酶体功能。碱性纳米颗粒，如二氧化硅纳米颗粒，可抑制 mTOR 活性，增加 TFEB 核定位，使内体 / 溶酶体去酸化，可能抑制病毒 RNA 释放，但也可能降低溶酶体活性，支持 SARS-CoV-2 感染；酸性纳米颗粒，如羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒，可促进溶酶体病毒降解和生物发生，但同时可能增加 CTSL 活性，产生复杂的抗 SARS-CoV-2 作用。
聚（D，L - 丙交酯 - 共 - 乙交酯）（PLGA）等酸性纳米颗粒可用于包裹抗病毒药物，积累在内体 / 溶酶体中，使内体 - 溶酶体重酸化，恢复溶酶体功能。PLGA 包裹的姜黄素纳米颗粒在体外具有抗 SARS-CoV-2 活性，但作用机制尚不清楚。
自 COVID-19 大流行以来，研究人员评估了多种纳米颗粒或细胞外囊泡平台的抗病毒活性。例如，含有 SARS-CoV-2 受体 ACE2 的细胞膜包裹纳米颗粒、肿瘤细胞来源的细胞外囊泡（如外泌体、微粒），以及截断的 ACE2 肽偶联的金纳米颗粒等，都能通过与病毒刺突蛋白受体结合域（RBD）结合，捕获和隔离 SARS-CoV-2，有效阻断感染。ACE2 过表达的 A549 细胞来源的微粒被 AM 摄取后，可将结合的 SARS-CoV-2 从吞噬内体转运到溶酶体，促进病毒降解，并抑制促炎 AM 的发展，在 SARS-CoV-2 感染小鼠模型中显示出良好的治疗效果且无副作用。
此外，氧化胆固醇（25 - 羟基胆固醇，OC）可增加内体 pH，降低溶酶体 pH。基于此，设计同时含有 ACE2 和 OC 的膜纳米颗粒，被 AM 摄取后，OC 可转移到内体膜上，有望捕获和清除病毒，这一策略值得进一步研究。总之，纳米颗粒或基于纳米颗粒的递送系统有望促进 AM 对治疗剂的摄取，但在临床应用前还面临诸多挑战，不过研究巨噬细胞靶向纳米颗粒有助于深入了解 SARS-CoV-2 与宿主的相互作用，推动 COVID-19 治疗方法的改进。
7. 讨论与结论
本综述总结了 AM 内体 - 溶酶体系统与 SARS-CoV-2 复制的相关性，并探讨了 AM 作为抗 SARS-CoV-2 感染治疗干预的关键抗病毒靶点。内体 - 溶酶体功能可促进病毒复制，而病毒进化也在不断重塑其复制和传播效率。以 Delta（B.1.617.2）变异株为例，其刺突蛋白的氨基酸替换使其更易通过内吞作用进入 AM，且内体 S 蛋白切割效率更高，增强了病毒感染性。不过，由于疫苗诱导的抗 S 蛋白抗体的作用，大多数感染 Delta 变异株的人症状轻微或无症状。
然而，SARS-CoV-2 变异株仍在传播，部分患者因药物安全风险无法接受治疗，如 Molnupiravir 禁用于孕妇，Paxlovid 禁用于移植患者和肾病患者。为此，本文提出一种潜在治疗策略，即通过改变 AM 内体 pH 阻断病毒 RNA 释放，调节 AM 溶酶体 pH 或增强溶酶体生物发生直接降解病毒，阻断病毒传播。同时讨论了生物分子和纳米颗粒靶向内体 - 溶酶体功能的意义，以及联合用药增强抗病毒效果的可能性。
但在利用调节内体 / 溶酶体 pH 的策略治疗 COVID-19 之前，需考虑内体 - 溶酶体酸化和去酸化在病毒复制不同阶段的不同作用。开发一种理想的抗病毒药物，既能增加内体 pH，又能降低溶酶体 pH 并增加溶酶体生物发生，逆转病毒诱导的溶酶体功能障碍，将对对抗 SARS-CoV-2 感染具有重要意义。此外，生物分子可能通过其他机制对内体 - 溶酶体系统功能产生额外调节作用，引发意想不到的抗病毒效果。因此，要合理设计有效的抗病毒药物，需深入理解各种抗病毒机制，开展大规模、精心设计的临床试验，才能将潜在的抗病毒药物应用于临床。
