PYROXD1 保护人 tRNA 连接酶复合物免受氧化失活的机制解析

研究人员为探究 PYROXD1 保护 tRNA 连接酶复合物（tRNA-LC）机制，解析相关结构，明确其作用及意义。

　　在生命的微观世界里，RNA 分子如同忙碌的 “小工匠”，参与着各种重要的生命活动。其中，tRNA（转运核糖核酸）在蛋白质合成过程中起着关键的 “搬运工” 作用，负责将氨基酸准确地运送到核糖体上，确保蛋白质的正确组装。而 tRNA 的成熟需要经过一系列复杂的加工过程，tRNA 连接酶复合物（tRNA-LC）在这个过程中扮演着不可或缺的角色，它参与 tRNA 前体的剪接，将剪接后的外显子连接起来，对 tRNA 的生物合成至关重要。此外，tRNA-LC 还参与未折叠蛋白反应，对维持细胞内环境的稳定意义重大。

然而，tRNA-LC 的催化亚基 RTCB（RNA 3'-phosphate cyclase and tRNA ligase 1）却面临着一个严峻的 “挑战”。RTCB 的催化中心含有一个高度保守且反应性很强的半胱氨酸残基，在有氧条件下，尤其是在铜离子等金属离子存在时，这个半胱氨酸残基极易被氧化，导致 RTCB 失活，进而影响 tRNA-LC 的正常功能。为了维持 tRNA-LC 在有氧环境下的活性，细胞进化出了一种保护机制 —— 依赖含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的氧化还原酶 PYROXD1 来保护 RTCB 的催化中心免受氧化。尽管此前已知 PYROXD1 能在体外以 NAD (P) H 依赖的方式与 RTCB 直接相互作用，维持 tRNA-LC 的连接酶活性，且其突变会导致肌病和结缔组织疾病等，但 PYROXD1 发挥保护功能的具体机制却一直是个未解之谜。

为了揭开这个谜团，来自苏黎世大学（University of Zurich）、维也纳医科大学（Medical University of Vienna）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Structural 》上，为我们理解 tRNA-LC 的保护机制提供了重要线索。

研究人员主要运用了低温电子显微镜（cryo-EM）技术，该技术能够在接近生理条件下对生物大分子的结构进行高分辨率解析，帮助研究人员直接 “看到” 蛋白质复合物的微观结构；同时结合了生化实验，从分子层面探究蛋白质之间的相互作用以及酶的活性变化。

研究结果如下：

• RTCB-PYROXD1 复合物的分子结构：研究人员首先通过亲和共沉淀实验确定了 RTCB 和 PYROXD1 稳定相互作用的最佳条件，发现其相互作用依赖 NAD (P) H 和二价阳离子。利用单颗粒低温电子显微镜对复合物进行分析，得到了分辨率为 3.3 ? 的分子重建模型。该模型显示，RTCB 和 PYROXD1 以 1:1 的化学计量比相互作用，PYROXD1 的 C 末端结构域（CTD）与 RTCB 的活性位点裂隙相互作用，形成了一个广泛的界面。同时，在 PYROXD1 的活性中心观察到了烟酰胺和黄素二核苷酸的清晰密度，基于 NADH 氧化动力学和复合物相互作用对 NAD (P) H 的依赖性，推断 PYROXD1 与 RTCB 相互作用时处于 NAD?-FADH?电荷转移复合物（CTC）状态。
• PYROXD1 的 C 末端尾巴保护 RTCB 催化中心：结构分析表明，PYROXD1 的 CTD 与 RTCB 的催化裂隙结合，阻挡了底物结合位点，使催化中心无法接近。其中，PYROXD1 的 C 末端尾巴（Ile493-Asp500）在与 RTCB 相互作用时尤为关键，它在游离的 PYROXD1 中是无序的，但与 RTCB 结合时会形成 α- 螺旋构象，插入 RTCB 的催化中心并与其形成疏水相互作用。通过对 PYROXD1 突变体的研究发现，C 末端尾巴的突变或截断会影响其与 RTCB 的结合能力，进而影响对 RTCB 的保护作用。在体外实验中，只有能够与 RTCB 结合的 PYROXD1 蛋白变体才能在过氧化氢处理后维持 tRNA-LC 的连接酶活性，这进一步证实了 C 末端尾巴与 RTCB 催化中心的相互作用对保护 RTCB 免受氧化失活至关重要。
• RTCB-PYROXD1 相互作用的变构机制：通过将 RTCB-PYROXD1 复合物结构与无 NAD (P) H 的 PYROXD1 晶体结构进行叠加，发现 NADH 结合、CTC 形成和 RTCB 招募会诱导 PYROXD1 发生结构重排。在游离的 PYROXD1 中，FAD 结合结构域内的一个高度保守的环（loop 1）结构有序且远离 FAD 辅因子；而在复合物中，loop 1 的构象变得不太明确，向 PYROXD1 活性中心移动以避免与 RTCB 发生空间冲突。同时，NAD (P) H 结合结构域也发生了结构重排，连接 NAD (P) H 结合结构域和 CTD 的 loop 2 在复合物中部分有序化，其内部的保守基序（motif 2）中的 Trp239 与 FADH?的黄素环发生侧面芳香堆积，导致 Trp376 位移，从而暴露 RTCB 结合界面。对 loop 2 突变体的研究表明，loop 2 不仅调节 PYROXD1 的氧化还原酶活性，还影响其与 RTCB 的结合能力，进而影响对 RTCB 的保护功能。
• PYROXD1 在 Archease 介导的鸟苷酸化之前保护 RTCB：结构比较发现，PYROXD1 与 RTCB 的相互作用会阻碍底物 RNA 的结合，抑制 RTCB 的催化活性。同时，PYROXD1 与 RTCB 结合时，会与 RTCB 结合 GMP 时的一个环发生空间冲突，且与鸟苷酸化的 RTCB 结合也会产生空间位阻，这表明 PYROXD1 选择性地与未鸟苷酸化的 RTCB 结合。实验结果也证实，PYROXD1 优先与未鸟苷酸化的 RTCB 结合，而鸟苷酸化的 RTCB 对氧化失活的敏感性较低，这意味着 PYROXD1 主要保护未鸟苷酸化的 RTCB，而鸟苷酸化的 RTCB 本身具有一定的抗氧化失活能力。
• PYROXD1 的再氧化控制 RTCB 的释放：RTCB 催化 RNA 连接的第一步是由 Archease 介导的 RTCB 催化中心的鸟苷酸化，由于 Archease 与 RTCB 的结合与 PYROXD1 相互排斥，因此在 Archease 介导的鸟苷酸化之前，RTCB-PYROXD1 复合物需要解离。研究发现，复合物的解离需要 PYROXD1 内的 NAD?-FADH? CTC 被电子受体（如分子氧）再氧化，导致 FAD 再生和 NAD?释放。体外实验表明，去除 NADH 后，RTCB-PYROXD1 复合物的半衰期约为 2 分钟，与 PYROXD1 CTC 的再氧化速率相符，这表明 PYROXD1 在被电子受体再氧化后会迅速从 RTCB 上解离，从而使 RTCB 能够被 Archease 激活进行后续的催化反应。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 PYROXD1 保护 RTCB 免受氧化失活的分子机制，强调了 PYROXD1 与 RTCB 的共进化是 tRNA-LC 在有氧条件下发挥功能的重要机制。PYROXD1 通过物理性地封闭 RTCB 的催化中心，抑制金属离子交换，防止活性位点半胱氨酸残基被氧化。同时，NAD (P) H 氧化酶活性作为分子计时器，控制 RTCB 的释放，使其能够被 Archease 激活。这一研究不仅为理解 tRNA-LC 的保护机制提供了理论基础，还为相关疾病的研究提供了新的视角，建立了氧化还原依赖的 RNA 加工途径调控的范例，对生命科学和健康医学领域的研究具有重要意义。