SMAD3 与 PINK1 正反馈调控线粒体自噬：解锁神经退行性疾病新机制

为探究 PINK1 转录调控机制，研究人员发现 SMAD3 与 PINK1 形成正反馈环调控线粒体自噬，助力理解神经退行性疾病。

　　在细胞的微观世界里，线粒体就像一个个 “能量工厂”，持续为细胞的正常运转提供能量。然而，当这些 “工厂” 出现故障时，细胞的健康就会受到威胁。线粒体自噬（mitophagy）作为一种关键的细胞机制，能够及时清除受损的线粒体，维持细胞的稳态。其中，PTEN 诱导激酶 1（PINK1）在这一过程中发挥着至关重要的作用。PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，正常情况下，它在细胞质中合成后会迅速进入线粒体，随后被线粒体蛋白酶切割降解。但当线粒体受损或去极化时，PINK1 的降解过程被抑制，它会在线粒体外膜上积累并激活，进而启动线粒体自噬。

尽管 PINK1 在维持线粒体质量控制方面的重要性已被广泛认知，但其转录调控机制在很大程度上仍是一个未解之谜。目前，关于 PINK1 的研究大多集中在其翻译后修饰（PTMs）上，而在急性线粒体损伤诱导的线粒体自噬背景下，对 PINK1 转录调控的研究还远远不够深入。这种知识的欠缺，使得我们在理解细胞应对线粒体损伤的完整机制以及相关疾病的发病机制上存在明显的不足。为了填补这一空白，澳门大学健康科学学院、精准肿瘤前沿科学中心等研究机构的研究人员开展了一项深入的研究，相关成果发表在《Cell Discovery》上。

研究人员运用了多种技术方法来探索 PINK1 转录调控的奥秘。在细胞实验方面，他们培养了 HeLa 细胞、HeLa YFP - Parkin 细胞、HEK293T 细胞和 SY5Y 细胞等多种细胞系 ，通过给予线粒体损伤剂处理，模拟线粒体受损的状态。在分子生物学技术上，采用了蛋白质免疫印迹（Western blotting）来检测蛋白表达水平，染色质免疫沉淀（ChIP） - seq 技术用于确定转录因子与基因启动子区域的结合位点。为了探究蛋白 - 蛋白之间的相互作用，进行了免疫共沉淀（Co - IP）实验。此外，还运用了分子动力学模拟（MD simulations）从理论层面分析蛋白结合的能量和关键位点。同时，研究人员利用人类大脑样本队列（如 GSE118553 和 GSE205450）进行相关性分析，进一步验证研究结果在人体中的相关性。

下面来看具体的研究结果。

1. SMAD3 与 PINK1 表达的关联：研究人员用线粒体损伤剂寡霉素和抗霉素 A（O/A）处理稳定表达 YFP - Parkin 的 HeLa 细胞（HeLa YFP - Parkin 细胞），发现 PINK1 的 mRNA 和蛋白水平均上调。使用放线菌素 D 抑制 mRNA 合成或环己酰亚胺阻断蛋白合成后，PINK1 的水平显著降低，且这一变化并非由线粒体膜电位（MMP）恢复或细胞死亡增加引起，表明线粒体损伤时 PINK1 处于活跃的转录和翻译过程，且该过程不依赖于 Parkin。通过生物信息学预测分析，研究人员发现 SMAD 家族成员 3（SMAD3）可能是调控 PINK1 转录的关键因子。进一步分析人类大脑样本队列数据发现，PINK1 和 SMAD3 的 mRNA 水平在颞叶皮层、额叶皮层、壳核和尾状核区域呈正相关，这初步暗示了 SMAD3 与 PINK1 表达之间的紧密联系。
2. SMAD3 是 PINK1 的正向核转录因子：为了验证 SMAD3 是否为 PINK1 的转录因子，研究人员构建了 SMAD3 稳定敲低的细胞系。结果显示，SMAD3 缺失导致 O/A 诱导的 PINK1 mRNA 水平显著下调。ChIP - seq 实验确定了 PINK1 启动子区域的三个潜在 SMAD3 响应元件（ARE1、ARE2、ARE3），其中 ARE1 和 ARE2 对 SMAD3 介导的 PINK1 转录至关重要。此外，线粒体损伤时，SMAD3 会发生核转位，这一系列实验结果表明 SMAD3 能够在线粒体损伤时促进 PINK1 的转录。
3. SMAD3 上调 PINK1 表达：研究人员分别通过药理学和遗传学方法，进一步探究 SMAD3 对 PINK1 表达的影响。使用 SMAD3 特异性抑制剂 E - SIS3 处理细胞，以及构建 SMAD3 稳定敲低细胞系，均发现 PINK1 及其下游的 p - Ub（Ser65）水平显著降低。而在 SMAD3 敲低细胞中重新表达 Flag - SMAD3，或过表达 SMAD3，能够恢复或增加 PINK1 的蛋白水平，这充分证明了 SMAD3 能够上调线粒体损伤时 PINK1 的表达。
4. SMAD3 调节 PINK1 转录不依赖于 TGFβ 信号通路：在经典的 TGFβ 信号通路中，SMAD3 通常与 SMAD2 和 SMAD4 协同作用来调控下游基因转录。但研究人员发现，敲低 SMAD2 和 SMAD4 并不影响线粒体损伤时 PINK1 和 p - Ub（S65）的水平，表明只有 SMAD3 参与 PINK1 转录的调控。TGFβ 刺激对 PINK1 和 p - Ub（Ser65）水平以及 PINK1 mRNA 水平均无影响，而使用 TGFβ - RI 抑制剂 Galunisertib 也无法阻断 O/A 诱导的 SMAD3 磷酸化，这些结果说明 SMAD3 调节 PINK1 转录的功能独立于经典的 TGFβ 信号通路。
5. SMAD3 促进线粒体自噬：由于 SMAD3 对 PINK1 表达具有正向调控作用，研究人员进一步探究其对 PINK1 依赖的线粒体自噬的影响。实验发现，SMAD3 抑制剂 E - SIS3 预处理或 SMAD3 敲低，均显著减少了 O/A 诱导的线粒体蛋白（如 MFN1、COXIV 和 TOMM20）降解，抑制了 Parkin 向线粒体的转位，阻断了线粒体 DNA（mtDNA）的清除，通过 mito - Keima 实验也证实了 SMAD3 抑制会降低线粒体自噬水平，这些结果表明 SMAD3 能够促进线粒体自噬。
6. SMAD3 被 PINK1 磷酸化：研究人员推测 PINK1 可能是 SMAD3 的直接激酶。分子动力学模拟显示，PINK1 与 SMAD3 的 MH2 结构域具有较强的结合能力。Co - IP 实验证实了 PINK1 与 SMAD3 在细胞内存在相互作用，且该相互作用依赖于 PINK1 的激酶活性。体外激酶实验表明，PINK1 能够直接磷酸化 SMAD3 的丝氨酸 423/425 位点，而 PINK1 敲除（PINK1 - KO）细胞中，O/A 诱导的 SMAD3 磷酸化明显减弱，重新表达 PINK1 后可恢复。此外，只有 SMAD3，而非 SMAD2，是 PINK1 磷酸化的直接底物。而且，在 O/A 诱导的线粒体应激下，SMAD3 会发生线粒体转位，而 TGFβ 刺激则不会。这些结果表明，PINK1 能够磷酸化 SMAD3，且这一过程在体内外均重要，二者形成了一个正反馈环。
7. 激活 SMAD3 提供抗线粒体应激的促生存机制：研究发现，敲低 SMAD3 后，细胞对 O/A 处理诱导的细胞死亡更加敏感，细胞凋亡相关蛋白 PARP 的切割增加。使用不同的细胞死亡抑制剂处理后发现，SMAD3 缺失导致的细胞死亡主要是通过凋亡途径，这表明 SMAD3 可能通过激活 PINK1 介导的线粒体自噬，对线粒体损伤起到抗凋亡的保护作用。

综合上述研究，研究人员发现了 SMAD3 在调控 PINK1 转录和线粒体自噬中的新功能，揭示了 SMAD3 和 PINK1 之间存在正反馈环，即 SMAD3 促进 PINK1 转录，而 PINK1 反过来磷酸化并激活 SMAD3。这一发现为理解线粒体自噬的分子机制提供了新的视角，有助于深入探究 PINK1 和 SMAD3 在神经退行性疾病（如帕金森病）发病机制中的病理功能。不过，该研究也存在一些局限性，例如 SMAD3 如何独立于经典 TGFβ 信号通路调控 PINK1 转录的具体机制尚不清楚，SMAD3 被 PINK1 磷酸化的精确位点还需进一步研究，并且需要在其他细胞类型（如原代神经元）和体内疾病模型（如帕金森病模型）中进一步验证这一关系。尽管如此，这项研究为未来开发针对线粒体或线粒体自噬相关疾病的治疗方法提供了潜在的靶点和理论基础，有望推动相关领域的进一步发展。