新冠病毒来源 circRNA 影响血管内皮细胞功能的新发现：circSARS-CV2-N1368 的关键作用

为探究新冠病毒 circRNA 对心血管后遗症的影响，研究人员聚焦 circSARS-CV2-Ns，发现 circSARS-CV2-N1368 可损害内皮细胞功能，为相关疾病治疗提供新思路。

　　新冠疫情已持续近 4 年，新冠病毒（SARS-CoV-2）引发的不仅是呼吸系统疾病，还与多种心血管疾病（CVDs）的发生风险增加密切相关，如心肌炎、急性冠状动脉综合征等。然而，目前对于 SARS-CoV-2 导致心血管疾病的病理生理机制仍知之甚少。SARS-CoV-2 在宿主细胞内复制时会产生多种非编码 RNA，其中环状 RNA（circRNA）具有独特的结构和功能。此前研究虽已预测 SARS-CoV-2 可编码多种 circRNA，但这些 circRNA 在 SARS-CoV-2 感染及相关疾病中的作用却鲜为人知。为深入了解 SARS-CoV-2 来源的 circRNA 对心血管系统的影响，来自华南理工大学医学院、广东省人民医院等机构的研究人员开展了相关研究，研究成果发表于《Acta Pharmacologica Sinica》。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：从 COVID-19 患者咽拭子样本、实验动物血清等获取样本；采用 RNA 提取及定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）检测相关 RNA 表达水平；通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白表达与激活情况；运用细胞增殖、迁移实验以及体内外血管生成实验探究细胞功能变化；构建腺病毒载体实现 circRNA 的外源性过表达；利用双荧光素酶报告基因实验、RNA Pull-Down 实验等验证分子间相互作用。

研究结果

1. 新冠病毒 N 基因来源 circRNA 的鉴定：研究人员从 SARS-CoV-2 的 N 基因中鉴定出 5 种 circRNA，即 circSARS-CV2-Ns。通过 PCR 扩增和测序，确定了它们的序列，其中 circSARS-CV2-N1368 还涵盖了 SARS-CoV-2 的 ORF8 基因序列。RT-qPCR 检测发现，circSARS-CV2-N654、-N804 和 - N1368 在患者咽拭子样本中表达相对较高，且 circSARS-CV2-N654 和 - N1368 在感染 SARS-CoV-2 的人源化 ACE2（hACE2）转基因小鼠外周血血清中也可检测到。此外，荧光原位杂交（FISH）实验表明这些 circRNA 主要分布在细胞质中，且对 RNase R 具有抗性，稳定性较高。
2. circSARS-CV2-Ns 促进血小板黏附：在人心脏微血管内皮细胞（HCMECs）中过表达 circSARS-CV2-Ns，结果显示 circSARS-CV2-N654、-N804 和 - N1368 均能增强血小板对 HCMECs 的黏附能力，其中 circSARS-CV2-N804 的作用更为显著。同时，过表达这些 circRNA 还会使 HCMECs 中炎症相关基因（如 IL-1β、IL-6、VCAM-1 和 ICAM-1）的 mRNA 表达上调。
3. circSARS-CV2-Ns 损害内皮细胞功能：在 SD 大鼠冠状动脉中过表达 circSARS-CV2-Ns，发现 circSARS-CV2-N1368 显著抑制内皮细胞依赖性舒张反应，降低 eNOS 激活和 VEGFA 表达。在 HCMECs 中，circSARS-CV2-N654、-N804 和 - N1368 抑制细胞增殖和迁移，circSARS-CV2-N1368 的抑制作用最强。此外，过表达 circSARS-CV2-Ns 还会增加细胞内活性氧（ROS）水平，抑制 HCMECs 形成管样结构的能力，减少体内血管生成。在人心脏类器官（COs）中，circSARS-CV2-N804 和 - N1368 使 COs 跳动次数减少，circSARS-CV2-N1368 降低 eNOS 和 VEGFA 的 mRNA 表达。
4. circSARS-CV2-N1368 与 miR-103a-3p 的相互作用：通过生物信息学预测和实验验证，发现 circSARS-CV2-N1368 可特异性结合 miR-103a-3p。RNA Pull-Down 实验和双荧光素酶报告基因实验证实了两者的结合，RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验表明这种结合由 AGO2 介导。转染 miR-103a-3p 可降低 circSARS-CV2-N1368 的表达水平，反之亦然。此外，在氧糖剥夺（OGD）或 TNF-α 处理的 HCMECs 中，miR-103a-3p 表达下降，提示其可能参与内皮细胞损伤过程。
5. circSARS-CV2-N1368 通过 miR-103a-3p/ATF7 轴损害内皮细胞功能：通过交集分析筛选出 5 个候选基因，RT-qPCR 和 RIP 实验表明 circSARS-CV2-N1368 可通过靶向 miR-103a-3p 上调激活转录因子 7（ATF7）的表达。转染 miR-103a-3p 或靶向 ATF7 的 siRNA（si-ATF7）可逆转 circSARS-CV2-N1368 对 HCMECs 功能的抑制作用，包括增加 VEGFA 表达、激活 eNOS 和 HH3、降低 ROS 水平、促进细胞增殖和迁移以及恢复管样结构形成能力。
6. circSARS-CV2-N1368 激活 TLR4/NF-κB/ROS 信号通路：RNA 测序和富集分析发现，ATF7 可调节 Toll 样受体 4（TLR4）信号通路。双荧光素酶报告基因实验证实 ATF7 可转录促进 TLR4 表达。免疫荧光实验显示，circSARS-CV2-N1368 过表达的 HCMECs 中 TLR4、ATF7 表达和 NF-κB p65 核定位增加。敲低 ATF7、TLR4 或 NF-κB p65 可逆转 circSARS-CV2-N1368 对 HCMECs 功能的损害，降低 ROS 水平。此外，研究还发现 PKC 激活的 NAD (P) H 氧化酶参与了 circSARS-CV2-N1368 促进的 ROS 生成过程。
7. ROS 清除可改善 circSARS-CV2-N1368 诱导的内皮细胞功能障碍：使用 ROS 清除剂 NAC 处理 circSARS-CV2-N1368 过表达的 HCMECs，发现 NAC 可逆转 eNOS 和 HH3 的失活、VEGFA 水平的降低，减弱 ATF7、TLR4 表达和 NF-κB 激活，缓解 circSARS-CV2-N1368 对 HCMECs 增殖、迁移和管样结构形成能力的抑制作用。

研究结论与意义

该研究首次鉴定出 SARS-CoV-2 的 N 基因来源的 3 种新型 circRNA，发现 circSARS-CV2-N1368 可抑制 HCMECs 增殖、迁移和血管生成，损害内皮细胞功能，这可能在 SARS-CoV-2 诱导的心血管后遗症中发挥重要作用。机制上，circSARS-CV2-N1368 通过海绵吸附 miR-103a-3p，上调 ATF7 表达，激活 TLR4/NF-κB/ROS 信号通路，促进 ROS 生成和氧化损伤。此外，ROS 清除剂 NAC 可改善 circSARS-CV2-N1368 诱导的内皮细胞功能障碍。这些发现为深入理解 SARS-CoV-2 感染导致的心血管疾病机制提供了新视角，circSARS-CV2-N1368 和 miR-103a-3p 有望成为治疗 COVID-19 相关心血管疾病的潜在核酸药物靶点，为开发新的治疗策略提供了理论依据。