综述：基于细胞的方法对药物性胆汁淤积性肝损伤机制的理解

这篇综述阐述了药物性胆汁淤积（DIC）的机制，介绍体外模型及预测方法，探讨未来方向。

　　

引言

药物性肝损伤（Drug-induced liver injury，DILI）是对处方药和其他物质的一种复杂不良反应，在患者发病率、死亡率、医疗系统成本和药物研发方面都带来了严峻挑战。从临床角度，肝毒性模式可分为肝细胞型、胆汁淤积型或混合型，其中胆汁淤积性损伤在 DILI 病例中占比可达 50%，约 73% 的胆汁淤积性 DILI 由单一处方药引起，如抗生素、抗真菌药等。胆汁淤积的主要特征是胆汁流动和分泌受阻，导致胆汁酸（Bile acids，BAs）在肝脏和 / 或全身积累，进而对肝细胞产生毒性。虽然多种因素可引发药物性胆汁淤积（Drug-induced cholestasis，DIC），但肝胆转运系统的功能改变被认为是主要机制。动物研究在药物研发中存在局限性，因此近年来人们致力于开发新的体外系统来预测 DILI，包括 DIC。本文将对与 DIC 相关的关键分子机制、目前用于评估药物胆汁淤积潜力的体外模型和技术进行综述。

BA 合成和转运

BAs 是胆汁中的主要有机溶质，由胆固醇通过 “中性” 和 “酸性” 两条主要途径从头合成，最终与牛磺酸或甘氨酸结合。结合型和未结合型 BAs 在肝细胞内可能进一步硫酸化或葡萄糖醛酸化，然后由胆管转运体释放到胆小管中。

参与 BA 稳态的主要转运体包括位于胆小管膜的胆汁盐输出泵（Bile Salt export pump，BSEP）和多药耐药蛋白 3（Multidrug resistance protein 3，MDR3），它们促进 BA 分泌，维持细胞内低水平有害 BAs。多药耐药相关蛋白 2（Multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）负责结合型 BAs 和有机阴离子的胆管输出。位于基底外侧膜的 MRP3 和 MRP4 在胆汁排泄减少时，将 BA 和多种内源性化合物及外源性物质排出到血液中。顶端钠依赖性胆汁盐转运体（Apical sodium-dependent bile salt transporter，ASBT）和有机阴离子转运多肽（Organic anion transporting polypeptide，OATP）介导 BAs 分泌后部分重吸收进入胆管细胞，有机溶质转运体（Organic solute transporter，OSTα-β/SLC51A 和 B）再将重吸收的 BAs 分泌到胆管周围丛，使其可再次进入胆汁。大部分初级 BAs 被转运到肠道和胆囊，经肠道细菌作用生成次级 BAs，如石胆酸（Lithocholic acid，LCA）和脱氧胆酸（Deoxycholic acid，DCA）。约 90% 的结合型和未结合型 BAs 通过肠肝循环和被动扩散在远端肠道被重吸收，然后由基底外侧转运体促进其从窦状循环重新摄取进入肝细胞，其中 Na⁺牛磺胆酸盐协同转运多肽（Na⁺ taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）通过 Na⁺依赖机制促进胆汁盐转运到肝细胞，OATP 则介导非 Na⁺依赖的胆汁盐和有机阴离子摄取。

药物性胆汁淤积的机制

DIC 可通过多种病理生理机制发生，主要起始事件包括转运体、肝细胞和胆小管改变，且这些机制与炎症、线粒体损伤、氧化应激、内质网（Endoplasmic reticulum，ER）应激等关键事件密切相关，但它们之间的因果关系往往较为复杂。

胆汁酸稳态、转运和代谢的改变

药物可通过多种方式导致 BA 转运不足，如直接作用于转运体（如利托那韦、吡格列酮等）、改变其基因表达（如异烟肼、波生坦等）或诱导其内化和 / 或降解（如利福平、环孢素等）。BSEP 是负责输出 BAs 的主要胆管转运体，其功能抑制与药物诱导的肝损伤相关，但体外抑制 BSEP 本身并非预测 DILI 的良好指标，其他 BA 转运体的功能改变也可能参与其中。药物还可通过与核受体（如法尼醇 X 受体，Farnesoid-X receptor，FXR）相互作用，减少转运体基因表达，如异烟肼可抑制 SIRT1 去乙酰化，阻止其与 FXR 相互作用，导致 BSEP 和 MRP2 表达降低，BAs 在肝细胞内积累。此外，一些转运蛋白的多态性形式可能增加个体对 DIC 的易感性。BA 的肝代谢也对其稳态至关重要，失衡会导致毒性积累。例如，利福平可抑制 FXR/SHP 通路，增加 CYP7A1 酶活性，促进 BAs 合成和积累。体外研究表明，强效胆汁淤积性药物可通过损害 BA 转运和代谢，导致细胞内疏水性 BAs 积累，这些 BAs 与 BA 诱导的肝损伤进展相关。

细胞极性和胆小管动力学的紊乱

胆汁淤积性药物可通过改变细胞极性发挥有害作用，如利福平可促进 MRP2 内化和降解，降低其在顶端膜的表达，减少 BAs 向胆小管的排出。此外，药物还可阻碍胆汁通过胆小管的正常流动，导致 BAs 积累，如异烟肼的代谢产物可干扰血红素合成，导致原卟啉 IX 在胆汁中积累，阻塞胆小管；氯丙嗪和环孢素诱导的胆汁淤积中，氧化应激可破坏细胞骨架蛋白 F - 肌动蛋白，降低胆小管收缩性，波生坦可降低肌球蛋白轻链激酶 2 磷酸化，导致胆小管扩张。

其他与胆汁淤积相关的机制

DIC 还与肝细胞损伤的多种机制相关，如线粒体损伤、氧化应激、炎症和 ER 应激。线粒体在细胞能量产生中起关键作用，易受毒性损伤，许多胆汁淤积性药物可导致线粒体损伤，如异烟肼可通过多种方式损伤线粒体。氧化应激在 DIC 中常见，增加的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）可氧化蛋白质、脂质和核酸，导致细胞凋亡，一些药物可通过促进氧化应激，导致 BAs 积累，进而引发 DIC。炎症与 DIC 常相伴，但因果关系尚不明确，高 BA 水平可能直接诱导趋化因子产生或中性粒细胞介导的炎症反应，ROS 过度产生也可介导炎症蛋白表达，导致肝脏炎症浸润和损伤。ER 应激也是胆汁淤积常见事件，利福平可通过激活 PXR 和诱导 CYP 基因表达，或下调 BSEP 等方式诱导 ER 应激。

预测胆汁淤积的细胞模型

为研究 DIC，人们开发和优化了多种体外系统，包括亚细胞系统、细胞二维模型和三维培养模型等，各有优缺点。

亚细胞模型

亚细胞系统用于临床前转运测定，包括非洲爪蟾卵母细胞、过表达特定转运体的昆虫或哺乳动物细胞系的反转膜囊泡和胆小管膜囊泡等。这些模型可通过相对经济高效的高通量测定，检测 BSEP 和其他外排转运体的抑制情况，但存在生理相关性差、缺乏多种转运体表达和生物转化能力等局限性，可能导致假阳性和假阴性结果。

细胞系和肝细胞模型

细胞系和肝细胞模型比膜囊泡更具生理相关性。过表达单一转运体的上皮样细胞系可用于摄取研究，双转染表达摄取和外排转运体的细胞系可用于跨细胞转运研究。肝细胞具有肝脏来源、多种功能转运体的生理表达和正常细胞代谢能力等优势，新鲜或冷冻保存的肝细胞悬液可用于摄取研究，但不适用于外排研究。三明治培养的肝细胞可恢复紧密连接、胆小管结构、细胞极性和向量转运功能，广泛用于评估肝胆汁处置、转运清除率、识别调节机制等，但存在肝细胞逐渐去分化、高质量人肝细胞来源受限和实验结果可重复性差等问题。人肝癌细胞系如 HepaRG 细胞，具有来源丰富、转运蛋白表达与肝细胞接近等优点，可用于高通量筛选，但存在细胞起源、转运体和药物代谢酶表达差异等局限性。诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化产生的肝细胞样细胞（Hepatocyte-like cells，HLCs）具有细胞极化、形成胆小管样结构等特征，但分化方案昂贵、耗时，其评估胆汁淤积性药物作用的潜力尚待进一步探索。

器官型培养模型

三维培养模型能更准确地反映肝脏生理学，稳定肝细胞功能，维持分化表型。人肝细胞、HepG2 和 HepaRG 细胞形成的无支架球体具有极化组织和胆管外排转运体及药物代谢活性，可用于长期重复药物暴露研究，比二维培养更能识别药物的代谢依赖性毒性，重现 DIC 相关机制。人多能干细胞自组装形成的类器官可形成胆小管网络，其转运体活性受胆汁淤积诱导药物影响。更复杂的三维培养系统如微图案共培养或微流控装置，在肝毒性研究中的应用仍有限。人精密肝切片保留了肝脏组织的结构和细胞间相互作用，有助于揭示胆汁淤积的代谢和信号机制，但存在新鲜人肝组织获取困难、技术要求高和短期维持等问题。

预测药物性胆汁淤积的实验方法

评估 DIC 的研究多基于测量转运体功能或对 BA 积累的影响，同时，“组学” 技术为研究 DIC 的基本机制提供了有力工具。

转运体功能 / 抑制测定

转运体功能测定在评估药物胆汁淤积潜力中至关重要。可使用荧光或放射性标记的 BA 计算其外排和累积摄取，如 [³H] 牛磺胆酸盐是 NTCP、OATPs 和 BSEP 的底物，通过测量在有无二价阳离子存在下化合物在胆小管中的浓度，可计算相关指标评估药物对转运体的影响。MRP2 的功能活性可通过分析其模型底物羧基二氯荧光素（Carboxydichlorofluorescein，CDF）的定位来评估，Cholyl-lysyl-fluorescein（CLF）可作为 BSEP 底物用于检测 BA 转运活性，5 - 氯甲基荧光素二乙酸酯（5-chloromethylfluorescein diacetate，CMFDA）测试可用于评估肝细胞外排载体抑制情况。

BA 谱

测量总内源性 BA 含量可评估药物的胆汁淤积潜力，研究发现强效胆汁淤积性药物可诱导未结合型疏水性 BAs 在细胞内积累，这些 BAs 可能是胆汁淤积性药物的潜在生物标志物。不同体外模型中 BA 的合成和分泌存在差异，有研究提出生物动力学模型来测量细胞内 BA，以判断药物是否通过抑制 BSEP 诱导胆汁淤积。

胆汁淤积指数

胆汁淤积指数（Cholestatic Index，CIx）通过评估 BA 混合物对测试化学品细胞毒性的影响，计算 EC₅₀值的比值来衡量药物的胆汁淤积风险，不同的 BA 混合物组合和浓度可用于研究药物在有无 BA 存在下对细胞模型的影响。

转录组学

转录组学分析可检测 DIC，已建立的胆汁淤积性 DILI 转录组特征包括炎症、氧化应激、ER 应激、细胞死亡和适应性反应相关基因的变化。通过分析药物处理后 BSEP 基因表达的变化，可对物质进行分类，还可比较不同体外模型和患者的基因表达谱，以深入了解 DIC 机制。

代谢组学

代谢物谱可用于识别胆汁淤积特征，如 DIC 中除了 BAs 下调，还存在磷脂前体减少等情况。对 HepaRG 细胞用波生坦处理后的代谢组学研究发现，多种代谢物发生变化，反映了胆汁淤积性药物诱导的线粒体功能障碍。整合 mRNA 和代谢物变化的研究可揭示更多与细胞机制相关的途径。

蛋白质组学

蛋白质组学可用于验证波生坦诱导的胆汁淤积在 HepaRG 细胞中的转录组学发现，对鉴定出的蛋白质进行功能通路分析，可发现与胆汁淤积相关的毒理学类别，有助于识别胆汁淤积的细胞反应。

miRNA 组学

微小 RNA（microRNAs，miRNAs）可在转录后调节基因表达，其表达变化与 DIC 相关。研究发现，环孢素处理后，一些 miRNAs 表达发生变化，部分差异表达的 miRNAs 与靶向基因的变化相关，可能参与 DIC 的发生发展。

高通量测定

为提高测定药物胆汁淤积潜力的通量，有研究提出通过高内涵筛选成像算法可视化胆汁 CLF 排泄的方法，该方法无需放射性标记底物，可直接在体外测量胆汁排泄，并评估细胞活力，避免了细胞毒性对结果的干扰。

其他测定

鉴于 DIC 涉及多种机制，测量 ROS 产生、线粒体膜电位、caspase-3 活性等指标可帮助理解 DIC 机制。此外，还可使用计算技术如定量构效关系分析来预测 BSEP 抑制剂，但由于导致 BSEP 抑制的药物结构多样，识别共同结构特征具有挑战性。近年来，结合组学数据和计算机模拟方法，有助于更好地理解 DIC 的分子机制。

未来展望

未来，新知识和技术的整合有望实现对药物胆汁淤积潜力的早期精确检测。DIC 是一种多因素现象，受药物和患者相关因素影响，深入了解其病理生理学机制和个体风险因素，有助于开发更安全的药物。同时，应考虑胆汁淤积对其他器官的影响，如胆血症性肾病。目前评估药物胆汁淤积潜力的方法多依赖转运体功能评估，未来应采用多种终点指标，并结合计算技术，综合考虑药物的处方方案和药代动力学特性，提高预测准确性。iPSC 衍生的模型可用于评估基因变异对药物代谢和转运系统的影响，为精准研究提供有力工具。