HRMR 策略：开启精准染色体编辑的新时代

为解决染色体编辑难题，研究人员开展 HRMR 策略研究，显著提升染色体重排效率，意义重大。

　　

在生命科学的微观世界里，染色体就像一本神秘的 “生命之书”，记录着生物体的遗传信息。然而，当染色体发生异常重排，如易位、缺失和倒位时，就如同书中的文字被打乱，会引发一系列严重的遗传疾病和癌症。目前，精准操控这些染色体重排面临着巨大挑战。传统的基因组编辑技术在寻找匹配序列时困难重重，而 CRISPR-Cas9 系统虽能引入靶向 DNA 双链断裂（DSB），但通过非同源末端连接（NHEJ）连接远端 DSB 的效率极低，替代方法如引导编辑（prime editing）虽能提高准确性，但效率又低于 NHEJ 途径。因此，开发高效精确的染色体编辑工具迫在眉睫。

为了攻克这些难题，上海科技大学生命科学与技术学院基因编辑中心以及苏州大学苏州医学院基础医学部细胞生物学系的研究人员展开了深入研究。他们提出了一种基于 CRISPR 的同源重组介导重排（HRMR）策略，并取得了重要成果，相关论文发表在《Genome Biology》上。

研究人员在研究中运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，借助 CRISPR-Cas9 系统在特定位置产生双链断裂。其次，构建了多种质粒，包括 Cas9/gRNA 质粒、同源供体质粒等，用于引入或传递编辑所需的元件。此外，通过转染技术将这些质粒导入细胞，之后运用流式细胞术分析、基因组 PCR、高通量测序等技术对编辑效果进行检测和分析 。

下面来看看具体的研究结果：

1. HRMR 策略可行性：研究人员开发了一种分裂 GFP 报告质粒，在引入两个远端 DSB 后发生重组，恢复 GFP 表达。将 Cas9、靶向报告基因的 sgRNAs 和供体质粒共转染到野生型 HEK293T 细胞三天后，流式细胞术分析显示，GFP 阳性细胞比例达到 21%，相比无供体对照组增加了三倍。测序结果表明，提供同源臂质粒时，约 77% 的 GFP 阳性细胞具有与供体一致的完整 “区域 1 - 区域 2” 序列（精确易位），这证明了提供同源供体可促进分离的 DNA 序列之间的重组，且同源重组是主要的修复方式。

2. 同源供体促进染色体重排：研究人员以 BCR 和 ABL1 位点为目标，模拟与慢性髓性白血病相关的费城染色体易位。利用两个靶向 ABL1 和 BCR 的 sgRNA 及 Cas9 引入双链 DNA 断裂，系统比较有无同源供体时的易位效率。结果显示，有同源供体时，重组效率比仅 NHEJ 提高了约 20 倍。在 11 种不同的染色体重排实验中，包括随机和病理性染色体重排，均证实同源供体显著提高了染色体重排效率，最高提升达 22 倍。在 Hela 细胞和人胚胎干细胞（hESCs）中，HRMR 也表现出显著优势，相比 NHEJ，效率分别提升 15 - 20 倍和 18 倍（随机染色体重排）、4 倍（病理性染色体重排）。这表明 HRMR 可高效构建癌症相关的染色体重排和从头重排，且适用于多种人类细胞类型。

3. 优化 HRMR 效率：研究人员对同源臂长度进行系统评估，发现随着同源臂长度减少，染色体重排效率降低，但 200bp 和 500bp 的同源臂在效率上无显著差异，120bp 以下的同源供体编辑效率明显降低，说明 200bp 的同源臂足以实现高效染色体重排。同时，实验表明使用两个同源供体可同时促进不同形式的染色体重排，且引入核定位序列（NIS）的供体，相比无 NIS 的供体，染色体易位效率提高 3 - 4 倍，相比无同源供体的 NHEJ，效率提高达 60 倍。

4. HRMR 与其他方法比较：研究人员比较了 HRMR 与野生型引导编辑（WT-PE）产生大基因组缺失的效率。在 HEK293T 细胞中模拟 16.8Mb 的缺失，结果显示 HRMR 效率比 NHEJ 高 6 倍，而 WT-PE 比 NHEJ 效率低 0.5 倍。Sanger 测序证实，HRMR 产生的插入缺失（indels）更少，表明它是一种更有效、准确的修复机制。

5. HRMR 的精确性：研究人员将 I-SceI 限制位点引入同源供体，用于 VEGFA/PRNP 易位和 RNF2/TRAC 易位模型。PCR 扩增和 I-SceI 消化显示，HRMR 介导的重排大部分含有 I-SceI 位点，说明其保真度高。Sanger 测序和高通量测序（HTS）结果表明，HRMR 介导的精确易位比 NHEJ 高 50 倍以上，精确易位修复事件的比例超过 95%，证明 HRMR 是精确连接的主要途径。

6. HRMR 效率的量化：研究人员开发了引物插入策略来量化 VEGFA/PRNP 位点 HRMR 介导的易位比例。在未分选的转染细胞中，约 70% 为野生型等位基因，约 20% 为 NHEJ 事件，约 10% 为 HRMR 介导的易位；在分选的转染细胞中，约 20% 为野生型等位基因，约 59% 为 indels，约 21% 为 HRMR 介导的易位。排除野生型序列后，约 75% 的扩增产物为 DNA 断裂后 VEGFA 基因直接连接形成的 indels，25% 为 HRMR 介导的染色体重排，且 HR 介导的易位占所有易位事件的 95%。

7. 错配情况下 HRMR 的活性：研究人员设计了偏离预期切割位点 60bp 的 sgRNAs 和具有 50 - 200bp 同源错配的供体进行实验。结果发现，错配的 sgRNAs 虽能提高效率，但修复通过 NHEJ 而非 HRMR；错配的供体也能提高效率，但效果不如匹配的供体。这表明即使存在显著错配，HRMR 仍保留部分活性。

8. 活细胞追踪 HRMR 过程：研究人员利用 CRISPRainbow 标记方法对 U2OS 细胞中 Chr3Rep 和 Chr13Rep 染色体的 DSB 末端进行实时可视化。实验发现，提供同源供体时，Chr3Rep、Chr13Rep 和供体中的 ParS 会发生分离和融合，Chr3Rep 基因的 Halotag 标记和 Chr13Rep 基因的 SNAP 标记平均距离从非同源供体时的 1.84μm 减小到同源供体时的 0.661μm，表明同源供体可增加 DSB 染色体区域之间的空间接近度，促进修复。

9. 抑制 NHEJ 途径增强 HRMR：DNA 依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）在 NHEJ 途径中起关键作用。研究人员使用 DNA-PKcs 抑制剂 M3814 处理 HEK293T 细胞，发现处理后四个位点的易位效率比未处理对照组提高 2 - 4 倍，且易位连接处的 indels 显著减少。此外，使用靶向 KU70/80 的 shRNA 和 DNA 连接酶 4 抑制剂 SCR7 pyrazine 处理，在 VEGFA/PRNP 和 BCR/ABL1 位点的易位效率也提高了 2 - 4 倍，进一步证明抑制 NHEJ 途径可促进 HRMR。

综上所述，本研究通过开发 HRMR 策略，证明了同源供体可显著提高染色体重排效率，并揭示了其潜在机制。这一成果为疾病建模、染色体生物学研究和治疗致病性染色体重排提供了强大工具，有望为相关遗传疾病和癌症的治疗带来新的希望 。同时，研究也指出 HRMR 效率受多种复杂因素影响，未来还需进一步深入研究，以不断优化该技术，使其更好地服务于生命科学和医学领域。