利用多能干细胞来源的动脉内皮细胞开发 3 毫米直径的动脉移植物

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　　### 利用多能干细胞来源的动脉内皮细胞开发 3 毫米直径的动脉移植物
在当今生命科学和医学领域，血管疾病的治疗一直是备受关注的焦点。其中，闭塞性动脉疾病是全球范围内导致死亡的主要原因之一。对于缺血性心肌病患者，外科血管重建手术（如冠状动脉搭桥术）能够改善患者的预后和死亡率，是治疗严重稳定型缺血性心脏病的标准疗法。然而，目前血管搭桥手术主要依赖的自体血管移植物存在诸多局限性，例如获取时具有侵入性，部分患者缺乏合适的可获取血管，且血管质量参差不齐。而异体血管移植物则会引发显著的免疫反应，导致移植物排斥；合成血管移植物虽然在大中直径血管中能保持长期通畅，但在直径小于 6 毫米的动脉中临床疗效不佳，像膨体聚四氟乙烯（ePTFE）在小直径移植物中，因其疏水性表面会减少内皮细胞黏附，进而引发血小板激活、血栓形成和顺应性降低等问题。因此，开发一种理想的小直径动脉移植物迫在眉睫。

多能干细胞（PSCs）具有自我更新和分化为人体任何细胞类型的能力，为解决这一难题提供了新的方向。此前研究已成功从 PSCs 中生成动脉内皮细胞（AECs），这些 AECs 在维持动脉通畅方面具有关键作用，如能产生较高水平的一氧化氮、降低白细胞黏附。而且，已有研究表明，对 PSCs 进行基因编辑，使主要组织相容性复合体（MHC）相关基因失活，有助于促进异体 PSCs 来源细胞的移植。基于这些背景，本研究旨在利用 PSCs 来源的 AECs 开发 3 毫米直径的动脉移植物，并在恒河猴模型中评估其功能。

高纯度 AECs 的生成

在构建动脉移植物的过程中，维持 AECs 的长期纯度至关重要。研究人员对人类 PSCs 来源的 AECs 进行长期培养研究时发现，若不进行细胞传代，培养 20 天后，AECs 的纯度会从最初的 96% 急剧下降到不足 2%，这可通过内皮标记物 CD31/PECAM1、CD144/CHD5 以及动脉特异性细胞标记物 DLL4 的表达变化得以证实。为解决这一问题，研究人员进行了高通量筛选，试图找到能特异性抑制非 AEC 生长的小分子。在筛选的 20,000 种化合物中，发现 C21、C23 和 C33 这三种小分子在处理四天后，可显著提高 CD144⁺DLL4⁺人类 AECs 的纯度。然而，当停止使用这些小分子进行长期培养时，AECs 的纯度又会丧失。同样的情况也出现在对人脐血来源的内皮祖细胞分化生成的 AECs 的筛选中。最终，研究人员借助基因编辑技术，利用 CRISPR-Cas9 将嘌呤霉素抗性（PuroR）基因敲入人类 PSCs 的CDH5位点，使得嘌呤霉素抗性依赖于衍生内皮细胞中 CDH5 的表达。经过嘌呤霉素处理的CDH5-PuroR AECs，通过去除不表达 CDH5 的细胞（非 AECs），纯度得到显著提升。更为重要的是，即使停止嘌呤霉素处理，人类 AECs 在至少 4 周的时间内仍能维持 99% 的 CD144⁺DLL4⁺纯度。类似地，通过将 PuroR 基因敲入恒河猴 PSCs 的PECAM1位点，也成功提高了恒河猴 AECs 的纯度，且这些 AECs 在长期培养中同样保持了高纯度，并具备动脉特异性功能，如较高的一氧化氮生成能力和较低的白细胞黏附性。

ePTFE 表面修饰改善 AEC 黏附

ePTFE 的疏水性使得细胞难以附着，这成为构建动脉移植物的一大障碍。研究人员尝试了多种涂层材料，包括玻连蛋白（VTN）、RGD 肽、纤连蛋白、胶原蛋白、基质胶、明胶和聚赖氨酸等，然而这些涂层均未能有效改善人类 AECs 的黏附。随后，受贻贝黏附蛋白成分的启发，研究人员采用多巴胺自聚合方法对 ePTFE 进行处理。经过优化，发现将 ePTFE 在多巴胺溶液中孵育 16 小时效果最佳，多巴胺涂层显著增强了人类 AECs 的黏附。但对于恒河猴 AECs，在多次实验中细胞黏附存在较大差异。为解决这一问题，研究人员开发了双层涂层方法，即在初始多巴胺涂层的基础上，再添加一层多巴胺或 VTN。结果发现，第二层 VTN 涂层能显著提高恒河猴 AECs 的黏附，扫描电子显微镜分析也证实了恒河猴 AECs 能附着在 ePTFE 表面。此外，研究人员还尝试单独使用 VTN 进行涂层，并通过超声或真空处理来增强涂层效果。结果表明，VTN 结合真空涂层可使恒河猴 AECs 的覆盖率接近 100%，且该方法避免了超声处理导致的 ePTFE 移植物渗漏问题，因此被用于后续研究。

构建在生理流动下维持内皮完整性的 3 毫米直径动脉移植物

为便于动脉移植物的生成，研究人员设计了一种定制的接种 / 培养装置。该装置可在一个设备内完成细胞接种、移植物成熟以及对剪切应力响应的测试，极大地简化了动脉移植物的生产过程。具体而言，先将涂层后的 ePTFE 组装在装置内，然后将细胞悬液注入其内腔，并置于接种机中旋转，使细胞均匀分布在 ePTFE 内腔。接种后，将 AEC-ePTFE 动脉移植物转移至细胞培养箱中静置培养 2 - 8 天，使其进一步成熟。为评估在剪切应力下内皮的完整性，研究人员将组装好的动脉移植物连接到模拟股动脉压力波形的生物反应器上，并设计了旁路流动系统来去除初始灌注时产生的气泡，避免气泡导致细胞脱落，减少实验误差。结果显示，经过一天的生理剪切应力作用，采用多巴胺和 VTN 双层涂层的恒河猴 AEC-ePTFE 移植物以及 VTN - 真空涂层的恒河猴 AEC-ePTFE 移植物均能维持内皮的完整性。

构建低免疫原性的 3 毫米动脉移植物

降低免疫排斥反应有助于延长细胞存活时间，因此研究人员推测低免疫原性的 MHC I 类和 II 类分子敲除的 AECs 可能有利于动脉移植物在异体环境中的植入。基于此，研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术从PECAM1-puro 恒河猴 PSCs 中生成了同基因的 MHC 双敲除（MHC-DKO）AECs，成功敲除了B2M和CIITA基因，使得 MHC-DKO 恒河猴 AECs 缺乏 MHC I 类和 II 类基因的表达。进一步研究发现，由 MHC-DKO 恒河猴 AECs 构建的血管移植物与由 MHC 野生型（MHC-WT）恒河猴 AECs 构建的、具有多巴胺和 VTN 双层涂层的移植物相比，在血管内皮衬里完整性和细胞黏附强度方面表现相似。

MHC-WT AECs 构建的 3 毫米动脉移植物在恒河猴中显示出 100% 的通畅率

为测试动脉移植物的通畅性、耐久性以及 MHC 匹配的重要性，研究人员建立了一种无需免疫抑制的异体恒河猴下肢动脉搭桥模型。将 3 毫米的 ePTFE 移植物手术植入恒河猴的股浅动脉，并通过超声每两周观察一次移植物的通畅情况，在移植物闭塞（通过超声观察）或 6 个月研究终点时取出移植物进行分析。研究评估了裸移植物（无 AEC 内衬的 ePTFE）、MHC-WT 恒河猴 AECs 内衬的移植物以及 MHC-DKO 恒河猴 AECs 内衬的移植物（每组 6 只动物）的失败率。在 6 个月的研究终点时，裸 ePTFE 移植物的通畅率仅为 50%，其余 50% 的移植物在 9 周内因血栓形成而闭塞。相比之下，具有多巴胺和 VTN 双层涂层、由 MHC-WT 恒河猴 AECs 内衬的移植物（MHC-WT_DV）在 6 个月的研究终点时 100% 保持通畅。然而，令人意外的是，具有多巴胺和 VTN 双层涂层、由 MHC-DKO 恒河猴 AECs 内衬的移植物（DKO-WT_DV）在植入后 17 周内，有 50% 因血栓形成或内膜增生而闭塞。为进一步确认 MHC-WT 恒河猴 AECs 内衬的动脉移植物长期维持通畅的能力，研究人员增加了一组 6 个具有 VTN - 真空涂层的 MHC-WT 动脉移植物（MHC-WT_V）进行研究，结果表明该组移植物在植入后 6 个月内 100% 保持通畅。综合这些结果，MHC-WT_DV 和 MHC-WT_V 组的动脉移植物（以下简称 MHC-WT 动脉移植物）展现出了用于异体动脉血管重建的潜力。

针对 MHC-DKO AEC 移植物的高失败率，研究人员进行了深入的免疫相互作用研究。由于 MHC I 类阴性细胞可通过 “缺失自我” 识别被自然杀伤（NK）细胞裂解，研究人员进行了 NK 细胞杀伤实验。结果发现，在恒河猴和人类中，MHC-DKO AECs 比 MHC-WT AECs 对 NK 细胞更为敏感。为进一步在体内验证这一结果，研究人员将人类 AECs 移植到 NSG-SGM3-hCD34⁺人源化小鼠模型中，结果与体外实验一致，MHC-WT AECs 在该小鼠模型中的存活率高于 MHC-DKO AECs，这表明 NK 细胞在介导对 MHC-DKO AECs 的免疫排斥中可能发挥重要作用。

3 毫米动脉移植物经历适度且稳定的重塑

过度的内膜增生会导致移植物狭窄，然而适度的重塑，包括内膜增生，对于静脉移植物适应动脉环境、确保动脉重建中静脉移植物的长期通畅是必要的。在本研究中，研究人员通过超声成像测量整个实验过程中的狭窄率（异常峰值速度除以最接近的正常速度）来评估动脉移植物的细胞重塑进展。一般来说，速度比小于 2 与移植物失败的低风险相关。研究结果显示，裸移植物和 MHC-DKO 移植物的速度比在实验过程中波动较大，而 MHC-WT 移植物的速度比则持续稳定，始终保持在 1.5 以下，仅在第 15 周出现暂时升高。这表明 MHC-WT 移植物的狭窄程度小于 25%，即经历了适度的重塑。组织学检查发现，6 个月通畅的移植物存在内膜增生，且主要位于移植物的近端和远端，各植入组的内膜增生程度相似。此外，与 MHC-DKO 组相比，MHC-WT 组的移植物中胶原蛋白积累较少，肌原纤维较多，且在研究终点时，MHC-WT 或 MHC-DKO 移植物的内膜（包括内皮下位置）均未观察到白细胞（CD45⁺细胞）和巨噬细胞（CD68⁺细胞）浸润，这些细胞仅在移植物失败的动物的机化血栓中被发现。

动脉移植物中宿主细胞对内皮的重新填充

在猴子和人类的研究中均发现，同种异体移植物的内皮会被 100% 的宿主细胞或供体和宿主细胞的混合物重新填充。在本研究中，对 MHC-WT 动脉移植物进行免疫染色发现，6 个月时移植物内存在内皮细胞，这与天然动脉相似。进一步通过对内皮细胞（CD144⁺）和非内皮细胞（CD144^-）进行分选，并分离基因组 DNA 进行 qPCR 分析，结果显示只有少量（25%）的内皮细胞是 PuroR⁺供体细胞，这表明大部分内皮细胞是由宿主（PuroR^?）细胞重新填充的。而且，所有非内皮细胞均来自宿主细胞，这意味着供体内皮细胞能够抵抗内皮 - 间充质转化，维持其细胞命运。综上所述，宿主细胞对内皮的重新填充可能有助于 3 毫米 MHC-WT 动脉移植物的长期通畅。

研究总结与展望

本研究成功解决了小直径动脉移植物开发中的多个关键挑战，包括移植物的有效性、免疫排斥和安全性问题。研究人员建立了从 PSCs 生成 AECs 并将其均匀接种到合成 ePTFE 血管移植物上的技术，所构建的 AEC-ePTFE 动脉移植物在生理流动下能够维持内皮完整性。在异体恒河猴模型中，MHC-WT 动脉移植物展现出了卓越的疗效，在非 MHC 匹配的动物中至少 6 个月保持 100% 的通畅率。虽然研究中尝试通过基因编辑构建低免疫原性的 MHC-DKO 动脉移植物，但结果显示其通畅率与裸 PTFE 移植物相似，可能是由于 NK 细胞对 MHC-knockout 细胞的快速清除。未来可对 AECs 进行更多修饰，如过表达 CD47 等，以减轻 NK 细胞的杀伤作用。

此外，研究还发现 MHC-WT 动脉移植物的内皮会被宿主细胞重新填充，这一现象为临时移植物的研究提供了新的思路，也引发了对长期植入和个性化治疗必要性的思考。所有在本研究中保持 6 个月通畅的植入物均显示出相似程度的内膜增生，尽管 MHC-WT 移植物内膜中的胶原蛋白积累较少，但内膜增生对临床的潜在影响仍需进一步研究。同时，还应研究其他患者合并症（如高血糖、血脂异常或糖尿病等）对 MHC-WT 移植物疗效的影响，因为这些疾病会通过炎症、重塑受损、血管顺应性改变和氧化等机制对血管组织工程构成挑战。

在安全性方面，研究人员采用嘌呤霉素抗性基因策略制备了高纯度的 AECs，其纯度在体内至少可维持 6 个月，有效消除了未分化的 PSCs，降低了细胞疗法中肿瘤发生或其他不良反应的风险。而且，本研究中使用的 FDA 批准的 ePTFE 支架具有显著优势，即使移植物因血栓形成或内膜增生而失败，ePTFE 支架仍能保持完整，为后续的医疗干预提供了可能，并且外科医生对其使用较为熟悉，有利于该技术的临床应用推广。

总体而言，本研究为利用 PSCs 来源的 MHC-WT AECs 生成 3 毫米直径的异体动脉移植物提供了一种有效的策略，推动了当前干细胞治疗策略的重新思考，为未来的临床应用开辟了新的途径。然而，研究也存在一些局限性，如样本量较小，可能会受到个体差异的影响；MHC-DKO 动脉移植物的研究模型有待进一步优化，可采用更先进的低免疫原性模型，如 MHC-DKO 与 CD47 过表达或 Edimer 相结合的模型，以深入探究低免疫原性动脉移植物对长期通畅率的影响。相信随着研究的不断深入，小直径动脉移植物的开发将取得更大的突破，为血管疾病患者带来更多的希望。