IRF4 在 Th17 和 iTreg 细胞中调控程序的综合特征分析

本文通过多组学研究揭示 IRF4 在 Th17 和 iTreg 细胞中的调控机制，为免疫研究提供重要资源。

　　

一、研究背景

转录因子干扰素调节因子 4（IRF4）是哺乳动物干扰素调节因子家族的九个成员之一，在先天和适应性免疫反应中发挥着关键作用。IRF4 的表达局限于免疫细胞，它是 T 细胞和 B 细胞分化的关键调节因子之一，其失调与癌症、多发性硬化等自身免疫性疾病密切相关。

辅助性 T 细胞 17（Th17）细胞在自身免疫性疾病的发生和发展中起着重要作用，其发育高度依赖 IRF4 的表达。调节性 T 细胞（Treg）细胞则有助于维持外周免疫耐受，防止自身攻击性免疫反应。虽然 Treg 细胞的产生不直接依赖 IRF4，但 IRF4 对其在特定环境和组织中的效应功能至关重要。

尽管已有众多研究聚焦于 IRF4 介导的基因表达在小鼠和人类 Th17 和 Treg 细胞谱系决定中的分子机制，但仍有许多潜在机制尚未完全明晰。多数研究主要关注 IRF4 转录的靶基因，且往往在细胞分化早期进行研究。同时，目前仅有少数研究将 IRF4 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据与其他 “组学” 数据进行全局整合，对于与 IRF4 协同调节基因转录的蛋白质也了解有限。

二、研究方法

本研究通过将亲和纯化（AP）、基于质谱的蛋白质组分析与 ChIP-seq 相结合，深入探究 IRF4 在 Treg 和 Th17 细胞中的作用机制。研究人员利用转基因小鼠模型，生成了体内生物素标记的 IRF4，通过 AP-MS 技术鉴定 IRF4 的相互作用蛋白，同时运用 ChIP-seq 技术确定 IRF4 调控的靶基因。此外，还对野生型（WT）和 IRF4 基因敲除（Irf4^?/?）小鼠来源的 Th17 和 Treg 细胞进行蛋白质组分析，以揭示 IRF4 对细胞功能的影响。

三、研究结果

1. IRF4 对 Th17 和 Treg 细胞效应功能的转录调控：研究发现，IRF4 在 Th17 和 Treg 细胞中的蛋白表达水平相似。缺乏 IRF4 时，Th17 细胞无法正常发育，IL-17 分泌减少，RORγt 表达显著降低；而 Treg 细胞的体外诱导不受影响，但 Irf4^?/?的 Treg 细胞与 WT 的 Treg 细胞在蛋白质表达模式上存在明显差异。

进一步的蛋白质组分析显示，Irf4^?/?的 Th17 细胞中，差异表达的蛋白质数量更多，且这些蛋白质与信号受体（调节因子）活性、转录共激活因子结合、水解酶活性等密切相关，同时参与 Th17 和 Treg 细胞的分化过程。此外，GO 富集分析表明，IRF4 缺失影响了 Th17 和 Treg 细胞中与蛋白质结合、细胞代谢相关的蛋白质表达，且在两种细胞类型中呈现出不同的代谢途径变化。值得注意的是，部分在 Th17 诱导条件下培养的 Irf4^?/? CD4⁺ T 细胞表现出 FOXP3 表达增加，呈现出更 “Treg 细胞样” 的表型，这表明 IRF4 在 Th17-Treg 细胞可塑性中起着关键作用。

2. IRF4 介导的基因转录受细胞亚型特异性蛋白复合物调控：为了确定与 IRF4 协同作用并驱动 Th17 或 Treg 表型的蛋白质，研究人员通过 AP-MS 技术分析了 CD4^Th17和 CD4^iTreg细胞中 IRF4 的相互作用组。结果共鉴定出 440 个 IRF4 相互作用蛋白，这些蛋白形成了一个紧密的网络。其中，一些蛋白在之前的研究中已被证实与 IRF4 相互作用，而本研究还发现了许多新的关联蛋白。

通过 STRING 网络分析，发现 IRF4 与 FOXP3、RORγt 等 Th17 和 Treg 谱系定义的转录因子存在直接关联。此外，研究还鉴定出 53 个在 CD4^Th17或 CD4^iTreg细胞 IRF4 相互作用组中差异富集或特异性检测到的蛋白，这些蛋白包括一些已知的驱动细胞类型特异性功能的转录因子。同时，研究还发现大量在两种细胞类型中共享的 IRF4 相互作用蛋白，GO 分析显示这些 “核心” 相互作用蛋白主要参与 DNA 模板化转录调控、染色质组织以及 RNA 加工等过程。

3. ChIP-seq 分析揭示 IRF4 结合伴侣的基序富集：ChIP-seq 分析结果显示，IRF4 在 CD4^Th17细胞中的结合区域数量约为 CD4^iTreg细胞的两倍，且在 CD4^Th17细胞中，IRF4 更多地结合在启动子区域，这进一步证实了 IRF4 在 Th17 细胞中的重要性。通过对免疫沉淀 DNA 片段的基序分析，发现了 133 种独特蛋白质的结合基序，其中许多基序在两种细胞类型中都有出现，但也有一些基序是细胞类型特异性的。

研究还发现，IRF4 通常与其他转录因子结合形成复合基序，且这些复合基序在 Th17 细胞的启动子区域更为常见，表明它们在维持 Th17 细胞功能中发挥着重要作用。此外，通过生物发光共振能量转移（BRET）实验，证实了 IRF4 与 ETV6、RNF40、FOXP3 和 FLI1 等蛋白的二元相互作用，并发现人类同源蛋白也存在类似的相互作用，这表明研究结果在一定程度上可推广到人类模型。

4. FLI1 对 CD4^Th17细胞功能至关重要：通过整合相互作用组、Bio-ChIP-seq 和 Irf4^?/?蛋白质组分析数据，研究人员确定了受 IRF4 驱动的基因调控直接影响的蛋白质。在 CD4^Th17细胞中，这些蛋白质主要与转录调控、Th17 细胞分化和葡萄糖代谢相关；在 CD4^iTreg细胞中，则主要参与蛋白质定位、脂质和 rRNA 结合 / 转运以及转录调控。

进一步研究发现，FLI1-IRF4 复合基序在与 Th17 表型相关的基因启动子 / 增强子区域富集，且抑制 FLI1 会显著损害 Th17 细胞的分化。此外，对多发性硬化患者来源的 Th17 细胞进行蛋白质组分析发现，与 CCR6^?对照群体相比，FLI1 的表达增加，这表明 FLI1 在人类 Th17 细胞中也具有重要作用。

四、研究讨论

本研究通过整合多种 “组学” 技术，对 IRF4 在 Th17 和 Treg 细胞中的作用机制进行了全面分析。研究结果进一步证实了 IRF4 在 Th17 细胞中的主导作用，同时揭示了 IRF4 在 Treg 细胞中的重要功能。通过 IRF4 相互作用组分析，发现了许多新的 IRF4 相互作用蛋白和复合 DNA 基序，为深入理解 IRF4 介导的基因调控网络提供了重要线索。

研究还发现，IRF4 与 FLI1 等蛋白的相互作用对 Th17 细胞的分化和功能至关重要，抑制 FLI1 会影响 Th17 细胞的分化，这为治疗与 Th17 细胞相关的自身免疫性疾病提供了潜在的靶点。此外，研究结果在一定程度上揭示了 IRF4 在 Treg 细胞中对 FOXP3 表达的调控机制，即 IRF4 可能通过与 SATB1 等蛋白相互作用间接抑制 FOXP3 的表达。

然而，本研究也存在一定的局限性。例如，由于采用 “批量” 方法分析细胞，无法解析偶尔发生或在部分细胞中发生的相互作用；同时，虽然证实了部分蛋白与 IRF4 的二元相互作用，但对于详细的结合机制，如在结构层面的信息，仍有待进一步研究。此外，对于 IRF4 与其他候选蛋白相互作用的生物学意义，还需要更多的遗传实验进行验证。

总体而言，本研究为深入理解 IRF4 在促炎和抗炎免疫反应中的基因调控程序提供了宝贵的资源，也为未来研究 IRF4 相关的免疫调节机制和开发新的治疗策略奠定了基础。