疼痛和性腺激素对雄性和雌性大鼠芬太尼自我给药的差异调节

这篇研究揭示了炎症性疼痛和性腺激素对大鼠芬太尼自我给药的性别特异性影响，为防治阿片类药物滥用提供新视角。

　　

一、研究背景

在美国，超半数成年人受疼痛困扰，阿片类药物虽常用于止痛，却极易被滥用，缓解疼痛是阿片类药物滥用最主要的自我报告动机，且疼痛程度会影响阿片类药物的复吸情况。在当前芬太尼引发的阿片类药物流行背景下，探究疼痛对阿片类药物滥用易感性的影响至关重要。

同时，疼痛和阿片类药物使用存在性别差异，女性往往报告更强烈的疼痛感受，而男性滥用阿片类药物和过量用药的情况更为常见。然而，其潜在机制尚不明确，性腺激素在其中的作用也常被忽视。中脑边缘多巴胺（DA）通路在药物成瘾中起关键作用，阿片类药物通过调节该通路中的腹侧被盖区多巴胺（VTA^DA）神经元来影响奖赏和动机。疼痛会干扰这一通路的正常功能，但其是否以性别特异性方式驱动适应性不良的阿片类药物使用仍有待研究。

二、实验方法

1. 动物实验：选用成年雄性和雌性 Long Evans 野生型及 TH-Cre 大鼠，在实验开始时，大鼠年龄为 8 - 10 周，体重 225 - 350g。实验前，大鼠需在动物设施饲养室适应环境至少 7 天，之后进行单笼饲养。实验全程在光照周期的白天进行，且大鼠可自由获取食物和水，不过在行为学研究开始前 2 天，需对其进行轻度食物限制（每天给予 10% 体重的食物），直至实验结束。所有实验操作均遵循华盛顿大学和美国国立药物滥用研究所（NIDA）动物护理和使用委员会的规定，并符合美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南。
2. 手术操作：包括为记录 VTA^DA神经元活动进行的病毒注射和光纤植入、卵巢切除术（OVX）或假手术（SHAM）、颈静脉插管以实现静脉注射芬太尼自我给药。
3. 构建炎症性疼痛模型：在颈静脉插管手术结束时，给大鼠右后爪注射无菌生理盐水（SAL）或完全弗氏佐剂（CFA），以此诱导持续性炎症性疼痛。
4. 芬太尼自我给药实验：在插管和后爪注射 CFA 或生理盐水 72 小时后，开始芬太尼自我给药（SA）训练。实验在操作条件反射箱中进行，每周训练 5 天，持续 3 周，每天训练 2 小时，采用固定比率 1（FR1）强化程序。实验结束后，部分大鼠继续进行渐进比率（PR）、剂量 - 反应测试，或进行消退和线索诱导的复吸测试。
5. 相关检测：采用 Hargreaves 足底测试和电子 Von Frey 测痛仪评估热痛觉过敏和机械痛觉过敏，用卡尺测量后爪厚度以评估炎症情况。
6. 药物干预实验：在 SA 第 3 周，对大鼠进行药物干预实验，包括给予设计受体激动剂（CNO）激活或抑制 DREADD，以及给予雌激素（E2）、雌激素受体 α 拮抗剂（MPP）、雌激素受体 β 拮抗剂（PHTPP）等药物。
7. 免疫组织化学检测：实验结束后，对大鼠进行心脏灌注，取脑进行固定、切片，通过免疫组织化学染色检测病毒表达和光纤 / 套管的位置。
8. 无线光度测量及分析：使用无线光度测量设备记录 VTA^DA神经元活动，分析自发钙瞬变事件率和芬太尼诱发事件的相关指标。
9. 数据统计分析：实验至少重复两次，采用多种统计方法进行数据分析，包括重复测量（RM）双向方差分析、双向方差分析、RM 三向方差分析等，并进行事后多重比较检验。

三、实验结果

1. 雄性大鼠在炎症性疼痛持续时自我给药更多芬太尼：在芬太尼 SA 训练的第 1 周，疼痛和性别对获取芬太尼的行为没有影响。但到第 2 周，CFA 处理的雄性大鼠比雌性大鼠摄入更多芬太尼，且在第 3 周，雄性大鼠的芬太尼摄入量持续增加，超过其他所有组。在消退和线索诱导复吸测试中，CFA 处理的雄性大鼠在消退训练第一天表现出更持久的觅药行为，且所有组在复吸测试中，雄性的反应幅度更大。
2. CFA 在雄性和雌性中产生相似炎症、痛觉和芬太尼镇痛效果，但增强雄性高剂量芬太尼摄入：CFA 可使大鼠后爪厚度显著增加，且在雄性和雌性中效果相似；同时，CFA 降低了机械痛觉阈值（PWT），在两性中的变化也相似。在芬太尼镇痛效果方面，不同性别和时间点之间无差异，且未发现耐受性或阿片类药物诱发的痛觉过敏现象。在动机测试中，CFA 雌性大鼠获得的芬太尼输注次数少于 SAL 雌性大鼠，而在剂量 - 反应测试中，只有 CFA 雄性大鼠表现出对高剂量（5μg/kg）芬太尼的偏好。
3. 无线体内光纤光度测量揭示性别和疼痛对 VTA^DA神经元活动的特异性影响：CFA 未改变雌性大鼠自发 VTA^DA事件的频率，但持续降低雄性大鼠的自发频率，不过这种差异在 SA 第 3 周消失。在芬太尼诱发的 VTA^DA反应方面，雌性大鼠的反应幅度和功效在整个 SA 过程中保持稳定，不受 CFA 影响；而雄性大鼠在 CFA 处理后，第 1 周反应减弱，随后逐渐增强，到第 3 周时，CFA 雄性大鼠的 VTA^DA瞬变幅度大于其他所有组，且该变化与芬太尼摄入量呈正相关。
4. 化学遗传学抑制 VTA^DA神经元可阻止疼痛雄性大鼠增加芬太尼 SA：在 SA 第 3 周，对雄性 TH-Cre⁺大鼠进行化学遗传学抑制实验，结果显示，给予 Gi-DREADD 表达的雄性大鼠 CNO 后，消除了其在第 3 周芬太尼摄入量的增加，同时减少了在 PR 测试中的反应，且芬太尼诱发的 VTA^DA活动也显著下降。
5. 化学遗传学刺激 VTA^DA神经元促进疼痛雌性大鼠增加芬太尼 SA：对 TH-Cre⁺雌性大鼠注射兴奋性 DREADDs（Gq），刺激 VTA^DA神经元活动后，CFA 雌性大鼠的芬太尼摄入量和芬太尼诱发的 VTA^DA神经元反应均增加。
6. 卵巢激素而非发情周期阶段介导雌性大鼠芬太尼 SA 和芬太尼诱发 VTA^DA→NAc 活动的抑制：研究发现，雌性大鼠在不同发情周期阶段的芬太尼摄入量无差异。但切除卵巢（OVX）后，雌性大鼠的芬太尼 SA 和芬太尼诱发的 VTA^DA→NAc 反应增强，表明卵巢激素在抑制雌性大鼠芬太尼使用方面起重要作用。
7. E2 对芬太尼 SA 和诱发 VTA^DA活动的影响取决于疼痛背景：对 OVX 雌性大鼠和完整雄性大鼠给予 E2 处理，结果表明，E2 的作用因性别和疼痛状态而异。在 CFA 雄性大鼠中，E2 抑制了芬太尼诱发的 VTA^DA活动和芬太尼摄入量；而在 OVX 雌性大鼠中，无疼痛时 E2 促进芬太尼 SA 和 VTA^DA活动，有疼痛时则无明显影响。
8. E2 通过 VTA ERβ 信号调节性腺完整大鼠疼痛时芬太尼诱发的 VTA^DA→NAc 活动：通过药理学方法操纵 VTA 中的雌激素受体（ERs），发现 CFA 雄性大鼠中，E2 通过 VTA ERβ 信号抑制芬太尼诱发的 VTA^DA→NAc 活动，而 OVX 雌性大鼠对 E2 无明显反应，SHAM 雌性大鼠的反应与雄性相似。

四、研究讨论

1. 疼痛和激素对阿片类药物使用的影响机制：本研究表明，炎症性疼痛会在雄性大鼠中诱导中脑边缘 DA 通路的神经适应性变化，从而持续促进芬太尼使用。雄性大鼠中，高幅度的 VTA^DA神经元反应与芬太尼摄入量同步增加，且这种反应是促进芬太尼使用的必要和充分条件。而雌性大鼠对疼痛相关的芬太尼使用增加具有一定的抵抗力，部分原因是卵巢激素的调节作用。E2 在不同疼痛状态下对 VTA^DA活动的调节作用不同，在有疼痛时起抑制作用，这与它通常对 DA 释放的增强作用相反。
2. 研究的局限性与未来方向：研究存在一些局限性，例如无法确定 E2 作用于 VTA^DA神经元还是其他神经元群体，也未考虑 G 蛋白偶联雌激素受体（GPERs）的作用。此外，激素补充、消耗或操纵的慢性影响以及 E2 与其他激素的相互作用仍有待进一步研究。未来研究应进一步明确 VTA ERβ 信号机制是否存在性别特异性，以及这些发现如何转化到临床人群。
3. 研究的临床意义：目前，在阿片类药物使用方面，存在许多与激素相关的未解决问题，如激素避孕药对成瘾易感性的影响、更年期和激素替代疗法对阿片类药物滥用的影响等。本研究强调了评估激素状态对药物使用影响的重要性，为个性化治疗策略的制定提供了理论依据，有助于在阿片类药物危机背景下改善疼痛治疗。

本研究通过对大鼠的实验，深入探讨了疼痛和性腺激素对雄性和雌性大鼠芬太尼自我给药的差异调节作用，为理解阿片类药物滥用的神经生物学机制提供了重要线索，对开发更有效的预防和治疗策略具有重要意义。