肝纤维化对小鼠肝细胞体内基因转移的影响：为肝脏基因治疗 “拨云见日”

为探究肝纤维化对基因治疗的影响，研究人员用 LV 和 AAV 载体开展研究，发现其影响因载体和纤维化状态而异。

　　在生命的长河中，肝脏就像一座精密的 “化工厂”，承担着众多重要的生理功能。然而，当肝纤维化悄然来袭，这座 “化工厂” 的正常运转就会受到影响。肝纤维化是一种病理状态，在许多遗传和后天获得性疾病中都会出现，它会让肝脏组织和代谢发生改变。而基于病毒载体的肝脏定向基因治疗，本是治疗遗传性肝脏疾病的希望之星，有望通过一次静脉注射来恢复肝脏功能。但问题来了，肝纤维化会不会影响病毒载体介导的基因治疗效果呢？这一疑问就像一片乌云，笼罩在肝脏基因治疗的发展道路上。

为了驱散这片乌云，来自意大利 IRCCS 圣拉斐尔科学研究所的 San Raffaele Telethon 基因治疗研究所、Vita-Salute San Raffaele 大学，以及法国 Généthon、巴黎 - 萨克雷大学等机构的研究人员（Chiara Simoni、Justine Nozi 等）展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了肝纤维化与肝脏基因治疗之间的复杂关系。

研究人员在此次研究中用到了多种关键技术方法。在动物实验方面，他们选用了 C57BL/6、Abcb11^-/-和 Agt^-/-等小鼠，遵循相关法规开展实验。为了诱导肝纤维化，采用给小鼠注射四氯化碳（CCl₄）和喂食含 3,5 - 二乙氧基羰基 - 1,4 - 二氢吡啶（DDC）饲料的方法建立化学诱导模型；同时利用 Abcb11^-/-和 Agt^-/-小鼠作为遗传模型。实验中，通过静脉眶后注射或尾静脉注射的方式给予小鼠慢病毒载体（LV）或腺相关病毒载体（AAV）。在检测分析上，运用多种检测手段，像测定血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）浓度评估肝脏损伤；用 ELISA 测定小鼠血浆中 hFIX 抗原浓度；通过肝组织病理分析观察肝脏纤维化和组织学变化；利用免疫荧光成像研究基因转移在肝小叶内的分布；借助数字滴度 PCR（ddPCR）测定载体基因组拷贝数（VCN）等。

下面来看具体的研究结果：

• CCl₄诱导的肝纤维化对 LV 和 AAV 载体转导的影响：给野生型（WT）小鼠注射 CCl₄6 周诱导肝纤维化，期间发现血清 ALT 和 AST 水平升高，表明肝脏受损。注射 LV 或 AAV 载体后，LV 处理的 CCl₄组小鼠血浆中 hFIX 水平、mCherry 阳性肝面积及肝脏 LV VCN 均低于对照组，而 AAV 处理的小鼠在 CCl₄组和对照组之间无明显差异。这说明 CCl₄诱导的肝纤维化会降低 LV 对肝细胞的基因转移效率，但对 AAV 载体转导无显著影响。
• DDC 诱导的胆汁性纤维化对 LV 和 AAV 载体转导的影响：用含 DDC 的饲料喂 WT 小鼠 5 周诱导胆汁性肝纤维化，小鼠血清 ALT 和 AST 水平升高，肝脏出现胆汁淤积、门静脉周围纤维化等。给予 LV 或 AAV 载体后，LV 处理的 DDC 组小鼠 hFIX 输出、mCherry 阳性肝面积和肝脏 LV VCN 均显著降低；AAV 处理的 DDC 组小鼠循环 hFIX、mCherry 阳性肝面积和肝脏 AAV VCN 也明显下降。这表明 DDC 诱导的门静脉周围纤维化会显著降低 LV 和 AAV 载体对肝细胞的基因转移效率。
• 肝纤维化对 LV 转导肝细胞及生物分布的影响：由于 LV 可转导多种肝细胞类型，为探究肝纤维化对 LV 转导肝细胞的影响及生物分布变化，研究人员开展了相关实验。给小鼠注射 CCl₄或 DDC 后给予 LV，结果显示，在血液中 LV 清除无明显差异，但肝脏和脾脏的 LV VCN 在肝损伤小鼠中降低，且肝细胞 VCN 与转基因输出相关。这证实肝纤维化会降低 LV 对肝细胞的基因转移效率，且主要是因为肝细胞转导减少，而非转基因表达问题。
• 轻度纤维化对 LV 和 AAV 载体转导效率的影响：为研究轻度纤维化对基因转移的影响，缩短小鼠接触 CCl₄或 DDC 的时间。3 周处理后，小鼠出现轻度肝脏损伤和纤维化。给小鼠注射 LV.mCherry 或 AAV.mCherry 后发现，CCl₄和 DDC 处理的小鼠 mCherry 阳性肝面积及肝脏 VCN 均降低。这表明轻度肝损伤也会对 LV 和 AAV 载体转导产生负面影响。
• Abcb11 缺陷导致的肝纤维化对 LV 和 AAV 载体转导的影响：研究人员对 6 月龄 Abcb11^-/-小鼠进行研究，发现其血清 ALP 升高，肝脏有轻度门静脉周围纤维化等。给予 LV.mCherry 或 AAV.mCherry 后，LV 处理的 Abcb11^-/-小鼠 mCherry 阳性肝面积减少，AAV 处理的小鼠也有类似情况且肝脏 AAV VCN 降低。这说明 6 月龄 Abcb11^-/-小鼠的轻度门静脉周围纤维化对 LV 和 AAV 载体介导的基因转移有轻微负面影响。
• Agt^-/-小鼠中 LV 和 AAV 载体转导情况：9 月龄 Agt^-/-小鼠有轻微门静脉周围纤维化，给其注射 LV.mCherry 或 AAV.mCherry 后，在 LV 和 AAV 载体处理的小鼠中，mCherry 阳性肝面积和肝脏 VCN 均无显著差异。这表明 Agt^-/-小鼠的轻微门静脉周围肝纤维化对基因转移到肝细胞无实质性影响。
• 肝纤维化对肝小叶内基因转移分布的影响：研究人员分析不同肝纤维化模型中基因转移在肝小叶区域的分布。通过免疫荧光染色标记门静脉周围区域和中央静脉周围区域，发现 LV 在正常小鼠中倾向于门静脉周围转导，而在纤维化模型中这种偏好降低甚至消失；AAV 载体在正常小鼠中倾向于中央静脉周围转导，在不同纤维化模型中其转导偏好有的增加有的减少。这说明肝纤维化会改变基因转移在肝小叶内的分布，且与载体类型和肝纤维化模型有关。

研究结论和讨论部分表明，肝纤维化会降低肝细胞的转导效率，但其影响因所用载体和组织状态而异。CCl₄诱导的毒性中央静脉周围纤维化主要影响 LV 转导，DDC 诱导的胆汁性纤维化对 LV 和 AAV 转导都有影响，Abcb11^-/-小鼠的轻度纤维化对两者转导影响较小，Agt^-/-小鼠的轻微纤维化对转导影响不明显。肝纤维化改变基因转移分布可能是多种因素造成的，如细胞外基质沉积、代谢状态改变、炎症细胞浸润等。虽然肝纤维化存在时基因转移仍可实现，但开发和实施肝脏定向基因治疗时，需考虑肝纤维化的存在、阶段等因素，合理选择载体平台、设计载体剂量和给药时间等。

这项研究意义重大，它为肝脏定向基因治疗照亮了前行的道路。以往肝纤维化对基因治疗的影响未被深入探索，而该研究详细揭示了其中的奥秘，为未来肝脏定向基因转移和编辑的发展提供了关键信息，有助于优化基因治疗策略，让更多肝脏疾病患者看到治愈的希望。