体内靶向造血干细胞（HSCs）的基因治疗研究进展

本文通过优化 AAV6 载体及相关参数，探究体内 HSCs 基因治疗，为临床应用提供参考。

　　

一、引言

造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）基因治疗是治疗造血系统遗传疾病的创新疗法，如镰状细胞病、严重联合免疫缺陷和范可尼贫血等。该疗法通过修饰或引入核苷酸序列到 HSC 基因组来治愈疾病，现有多种技术可实现 HSC 基因组的遗传修饰，包括慢病毒载体、基因组编辑酶和基于同源定向修复（Homology - directed repair，HDR）的方法等。这些技术在体外（ex vivo）应用时已成功治愈一些遗传血液疾病，但体外 HSC 基因治疗存在技术复杂、成本高昂的问题，使其临床推广面临挑战。

相比之下，体内（in vivo）基因治疗具有显著优势，其载体可大规模生产，通过简单注射给药，无需化疗预处理，能提高患者治疗的可及性。在众多体内基因治疗载体中，腺相关病毒（Adeno - associated virus，AAV）脱颖而出，AAV 具有表达治疗性转基因和提供 DNA 模板用于靶向整合的双重能力，在体内和体外 HSC 基因治疗中均展现出一定疗效。然而，目前对于不同方法实现 HSCs 体内转导的系统研究较少。本研究旨在开发并优化 AAV 载体实现 HSCs 体内转导的方法，系统比较不同转导途径，重点研究 AAV6 在体内 HSC 基因治疗中的应用。

二、研究结果

1. AAV6 可在体内转导 HSCs为探究 AAV6 能否在体内转导小鼠 HSCs，研究人员使用编码巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）-Cre-SV40 表达盒的 AAV6 载体和 Ai14 小鼠进行实验。在 Ai14 小鼠模型中，成功转导细胞并表达 Cre 后，可通过 tdTomato（TdT）表达检测。研究发现，以 1e12 载体基因组（vector genomes，vg）的剂量经眼眶后（Retro - orbital，RO）注射 AAV6 载体，能成功转导并诱导 Lin^?Sca1⁺c - Kit⁺（LSK）造血干细胞和祖细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）发生 Cre 重组。且与骨髓（Bone marrow，BM）中的其他细胞类型相比，HSPCs 更易被 AAV6 载体转导，注射后 3 - 4 周，平均 16% 的 HSPCs 呈 TdT 阳性，而总 BM 细胞中仅 3% 呈阳性。此外，AAV6 载体经 RO 注射后也可转导外周血（Peripheral blood，PB）细胞，但频率低于 BM 细胞。同时，研究还发现肝脏对 AAV6 的摄取是影响其向 HSCs 递送的限速因素，高剂量的 AAV6 可使肝脏饱和，从而实现向 HSCs 的有效递送。
2. 比较靶向 HSC 特异性递送方法鉴于肝脏摄取对 AAV6 向 HSCs 递送的限制，研究人员进一步探究了将载体从肝脏转移到 BM 的方法。他们系统研究并比较了局部注射途径、HSCs 动员后 RO 注射以及标准静脉注射等方式。结果显示，经尾动脉和 RO 注射 AAV6 后，BM 中 TdT⁺细胞频率无显著差异；直接向 BM 进行股内（Intra - femoral，IF）注射与 RO 注射相比，也未发现显著差异，这表明 BM 可直接从血液中接触到 AAV6，即使局部注射也会使 AAV6 迅速进入血液循环并全身分布。另外，使用粒细胞集落刺激因子（Granulocyte - colony stimulating factor，GCSF）和普乐沙福（Plerixafor）动员 HSCs 后再注射 AAV6，反而导致 BM 细胞和 HSPCs 的转导率显著下降。
3. 优化体内转导检测的遗传结构研究人员发现，商业 AAV6 - Cre 载体的遗传结构可能并非最适合 HSPCs 中转基因表达。其使用的 CMV 启动子在造血细胞类型中可能被沉默，SV40 多聚 A 信号也可能不利于 RNA 稳定。为此，研究人员构建了一系列表达 GFP 的 AAV6 载体，比较不同启动子和多聚 A 信号尾在 HSPCs 中的活性。结果显示，无论使用何种载体，在体外将其应用于扩展的 C57BL/6J HSCs 时，GFP 表达频率和强度均较低。考虑到 AAV6 在许多组织中转基因表达的限速步骤是第二链合成，研究人员推测在 HSCs 中检测到的低表达可能源于此。通过使用自互补 AAV（Self - complementary AAV，scAAV）载体可绕过第二链合成步骤，研究发现 scAAV6 载体在 HSCs 中能显著提高 GFP 表达和 Cre 重组率。
4. 使用 scAAV6 在体内转导 HSCs在体外实验中发现 scAAV6 载体可显著提高 HSCs 的重组率后，研究人员将其应用于体内实验。向 Ai14 小鼠经 RO 注射 scAAV6 载体后，与原始的单链 AAV6（Single - stranded AAV6，ssAAV6）载体相比，scAAV6 在体内实现了更高的 AAV6 转导和重组率，在 BM、LSK HSPC 和 CD150⁺CD48^?LSK HSC 群体中均有显著提升。通过数字滴液 PCR 检测发现，注射 ssAAV 和 scAAV 后，小鼠 BM 中 AAV 基因组频率无显著差异。但将 Cre 直接导入小鼠 HSCs 基因组后发现，持续表达 Cre 的 HSCs 会受到负向选择，这可能导致 AAV 基因组在细胞增殖过程中丢失，也可能是由于 Cre 表达的细胞毒性作用。此外，接受 scAAV6 治疗的小鼠 PB 中重组率也更高。通过将注射 AAV6 的小鼠 BM 移植到辐照受体中，证实了功能可移植的 HSCs 在注射 AAV6 载体的小鼠 BM 中被转导，但移植后小鼠 PB 中 TdT⁺细胞频率显著下降，这可能表明功能性 HSCs 的转导频率低于免疫表型 HSCs，也可能是 AAV 转导或 Cre 表达降低了转导细胞的适应性。
5. 肝脏摄取限制 AAV6 载体体内系统递送对注射 scAAV6 载体的小鼠进行成像分析发现，低剂量（1e11 vg）注射时，肝脏中 TdT 表达水平高，其他组织中荧光水平低；高剂量（1e12 vg）注射时，肝脏和其他多种组织（如肠道、卵巢和皮肤）中均有高表达。这表明即使在低剂量下，肝脏对 AAV6 的转导也已接近饱和，从而促进了 AAV6 向 HSCs 的系统递送，但由于 ssAAV6 载体转基因表达低，这种现象在注射 ssAAV6 时未被检测到。

三、讨论

本研究表明 AAV6 载体可高效在体内转导功能性 HSCs，并提供了优化的体内转导方案和用于检测 HSCs 转导的 scAAV6 载体。研究发现 HSCs 在 BM 中易于被转导，且与其他 BM 细胞类型相比，具有优先被转导的特性。第二链合成是 AAV6 载体在 HSCs 中转基因表达的限速步骤，使用 ssAAV6 载体可能会低估 AAV6 在许多组织中的转导，尤其是在 HSCs 中。然而，scAAV6 数据显示，即使在中等剂量下，AAV6 也能以临床相关频率转导免疫表型 HSCs。

AAV6 载体可作为体内向 HSCs 递送 DNA 模板的有效载体，与其他递送载体（如脂质纳米颗粒，Lipid nanoparticles，LNPs）联合使用，可实现基因编辑酶（如 CRISPR - Cas9）的瞬时递送，有望用于治疗遗传血液疾病。研究还发现，HSCs 在 BM 中优先被转导，可能是由于其位于血管龛中，更接近血流，便于被 AAV6 载体转导，但也可能与载体嗜性等其他因素有关，需进一步研究。

此外，本研究中移植小鼠的重组率显著低于移植 BM 的免疫表型 HSCs，且 AAV 基因组在注射后 3 - 4 周在 BM 中的频率较低。这可能是因为 AAV6 载体转导 HSCs 会导致细胞分化和植入能力降低，高表达的 Cre 会对细胞造成 DNA 损伤，从而影响转导 HSCs 的适应性。尽管如此，研究数据表明长期功能性 HSCs 可被 AAV6 载体以临床相关频率转导，并在转导后长期保持自我更新和多能分化能力。

综上所述，本研究强调了 AAV6 载体在体内 HSC 基因治疗中的潜力，同时也指出了其有效应用面临的挑战和需要考虑的因素。深入了解 HSC 体内转导的细节，如细胞屏障、嗜性、最佳递送方法和脱靶效应等，对于推进体内 HSC 基因治疗以治疗遗传造血疾病至关重要。研究人员期望本研究中的许多原则也适用于其他类似的体内递送方式，为未来研究奠定基础。