Rac1 和 STRIPAK 复合物在施万细胞发育中的作用

这篇研究揭示了 Rac1 和 STRIPAK 复合物在施万细胞（SC）发育中的关键作用及相关机制。

　　

研究背景

在周围神经系统（PNS）发育过程中，施万细胞（SCs）的径向分选是轴突正确髓鞘形成的前提条件。SCs 通过将细胞质延伸插入轴突束，对单个轴突进行分类和髓鞘化，这一过程依赖于 Rac1 介导的细胞骨架重组 。然而，目前对于 Rac1 的直接效应器了解有限。同时，Hippo 通路也参与了 SCs 的径向分选，其效应器 YAP 和 TAZ 对 SCs 的发育至关重要，但在 SCs 中调节 YAP 和 TAZ 的其他机制尚不清楚。

研究目的

本研究旨在鉴定 Rac1 的下游效应器，探究其在 SCs 发育过程中的作用机制，以及与 Hippo 通路之间的关系。

研究方法

1. 筛选 Rac1 相互作用蛋白：通过对出生后 5 天（P5）小鼠周围神经裂解物中活性和非活性形式的 Rac1 进行下拉实验，筛选与 Rac1 相互作用的蛋白，并利用共免疫沉淀（coIP）和邻近连接测定（PLA）在 SCs 中进行验证。
2. 构建基因敲除小鼠模型：利用 SCs 特异性表达 Cre 重组酶的小鼠，构建 Strn3^SCKO、Strn1/3^dSCKO、Strn3/4^dSCKO、Strn1/4^dSCKO和 Rac1^SCKO等基因敲除小鼠模型，研究相关基因缺失对 SCs 发育的影响。
3. 细胞培养与处理：分离培养原代大鼠 SCs（rSC）、小鼠 SCs（mSC）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并对其进行相应处理和检测。
4. 多种实验技术检测：运用蛋白质免疫印迹（western blot）、RNA 提取和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫荧光、形态学评估等实验技术，检测相关蛋白和基因的表达水平、细胞形态变化以及神经发育情况。

研究结果

1. Rac1 与 STRN3 和 MOB4 直接相互作用：通过下拉实验、coIP 和 PLA 实验证实，STRN3 和 MOB4 这两个 STRIPAK 复合物成员与 Rac1 在组织和细胞中存在直接相互作用，且在低浓度和分离状态下，STRN3 与非活性 Rac1 的结合更强。
2. STRN3 对 SC 伸长和突起延伸至关重要：Strn3^SCKO小鼠的 SCs 中，STRN3 蛋白表达缺失，与对照组相比，Strn3^SCKO的 SCs 形成的径向和总片状伪足数量显著减少，细胞伸长也存在明显缺陷，表明 STRN3 是 SC 细胞骨架动力学的关键调节因子。
3. Striatin 家族蛋白表达具有发育调节性：在野生型（WT）小鼠周围神经发育过程中，STRN1、STRN3 和 STRN4 的表达模式相似，在径向分选和髓鞘形成进行时表达较高，在 P20 这些过程完成后表达显著降低。此外，在 Strn3^SCKO小鼠 P10 时，STRN4 出现显著上调，提示其他 striatin 蛋白可能会补偿 STRN3 的缺失。
4. Striatins 对 SC 径向分选必不可少：单个 striatin 蛋白（Strn1^SCKO、Strn3^SCKO或 Strn4^SCKO）缺失对髓鞘化纤维数量、密度和坐骨神经厚度影响较小，但 Strn1/3^dSCKO和 Strn3/4^dSCKO小鼠出现严重的径向分选和髓鞘化缺陷，包括未分选轴突束、异常髓鞘化轴突、分选但未髓鞘化轴突等，表明 striatins 对 SC 径向分选和后续髓鞘形成至关重要，且各成员可部分补偿彼此功能。
5. STRN1 和 STRN3 对 SCs 中 Hippo 通路调节至关重要：Strn1/3^dSCKO小鼠的 SCs 中，其他 STRIPAK 复合物成员（如 MOB4、STRIP1 和 CCM3）的蛋白水平发生改变，同时 Hippo 通路相关蛋白 MST1、MST2、YAP 和 TAZ 的磷酸化水平增加，总蛋白水平降低，mRNA 水平也部分下降，表明 Strn1 和 Strn3 的缺失导致 Hippo 通路抑制。
6. Rac1 对 SCs 中 Hippo 通路调节也很重要：Rac1^SCKO小鼠的 SCs 中，Hippo 通路成员的磷酸化水平增加，MST1/2 总蛋白水平降低，与 Strn1/3^dSCKO小鼠存在相似的表型，说明 Rac1 缺失会导致 Hippo 通路过度激活，进而抑制 YAP 和 TAZ。
7. STRN1、STRN3 和 Rac1 调节 SC 层粘连蛋白受体表达和分化：Strn1/3^dSCKO和 Rac1^SCKO小鼠的周围神经中，多种层粘连蛋白受体（如 Itga6、Itgb1 和 Itgb4）的 mRNA 和蛋白水平下调，同时转录因子 Egr2 表达降低，Pou3f1 表达增加，SCs 增殖出现异常，表明这些基因通过调节 Hippo 通路、YAP 和 TAZ，影响 SCs 中与发育关键相关的基因表达。

研究讨论

1. 研究发现的意义：本研究首次发现 Rac1 与 STRN3 和 MOB4 之间的相互作用，揭示了 striatin 家族蛋白在 SCs 轴突径向分选和分化中的重要作用，以及 Rac1 或 STRN1/3 缺失对 Hippo 通路信号、YAP/TAZ 活性、层粘连蛋白受体表达和转录因子 Egr2 表达的影响。这些发现为深入理解 SCs 发育的分子机制提供了新的视角。
2. 与其他研究的关联及差异：先前研究对 Rac1 在不同细胞类型中对 Hippo 通路信号和 YAP/TAZ 活性的影响存在争议，且对 NF2 在介导部分挽救以及 Rac1 和 CDC42 突变小鼠差异的机制了解有限。本研究表明，在体内敲除 Rac1 会导致 Hippo 通路激活和 YAP/TAZ 抑制，影响层粘连蛋白受体和转录因子表达，这可能是 Rac1^SCKO和 CDC42^SCKO小鼠部分周围神经发育缺陷的原因，Strn1/3^dSCKO小鼠的更严重表型可能也与此机制相关。
3. STRIPAK 复合物的其他作用及机制探讨：STRIPAK 复合物除了调节 Hippo 通路外，还参与多种细胞功能。在 Strn1/3^dSCKO模型中，层粘连蛋白受体亚基表达的严重破坏以及对肌动蛋白细胞骨架的直接影响，可能是导致其表型的原因，且这些机制可能与 Hippo 通路无关。此外，调节肌动蛋白细胞骨架也可独立于 Hippo 通路调节 YAP 和 TAZ。
4. 研究的潜在应用及方向：Rac1 和 STRIPAK 复合物的相关亚基是可成药靶点，本研究为通过调节这些靶点来干预周围神经发育、治疗周围神经疾病和肿瘤提供了理论依据。未来研究可进一步探究 Rac1-STRIPAK 相互作用的目的，以及通过转基因、药物干预等手段调节相关通路的具体机制和效果。同时，研究中发现的 MST1/2 激酶总水平降低的现象，可能代表一种新的 Hippo 通路调节反馈回路，值得深入研究。STRN3 在维持 STRIPAK 复合物稳定性和功能中的重要作用，也为研究 Hippo 通路在多种疾病中的作用提供了新的切入点。
5. 研究的局限性：在 RAC1 与 STRN3 和 MOB4 的相互作用研究中，存在结合偏好性的矛盾证据，且未探究其他复合物成员对该相互作用的影响以及该相互作用的目的和影响的信号传导。此外，在分析 Strn1/3^dSCKO小鼠的蛋白和 mRNA 水平时，使用的内参基因 GAPDH 可能会对部分结果产生影响，需要进一步验证。

综上所述，本研究揭示了 striatin 蛋白在 SC 径向分选和髓鞘形成中的关键作用，以及 Rac1 或 STRN1/3 缺失导致的层粘连蛋白受体表达和 SC 分化缺陷与 Hippo 通路信号失调的关系，为周围神经发育、疾病和肿瘤研究提供了重要的理论基础和潜在的治疗靶点。