神经丝轻链（NfL）在神经退行性疾病中的释放机制及作用研究进展

本文揭示神经丝轻链（NfL）释放机制，发现其可激活髓样细胞，是神经退行性疾病潜在靶点。

　　

引言

神经元损伤会导致神经元成分释放到细胞外空间，进而进入脑脊液（CSF）和外周血。细胞类型特异性细胞骨架蛋白可作为生物标志物候选物，用于监测疾病进展和治疗效果。神经丝轻链（Neurofilament light chain，NfL）是一种神经元特异性细胞骨架蛋白，在轴突中含量丰富，对维持轴突的大小、管径和机械完整性至关重要。在多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）中，脑脊液和血液中 NfL 水平的升高与疾病严重程度和进展相关，并且 NfL 水平还可用于预测疾病的进程和严重程度。尽管 NfL 作为疾病生物标志物已被广泛研究，但 NfL 从神经元释放的潜在机制以及释放的 NfL 对周围细胞的影响仍不清楚。有研究表明，NfL 基因的破坏在某些神经退行性疾病模型中具有有益作用，这表明 NfL 可能直接促进疾病进展。因此，本文旨在探究 NfL 在神经退行性疾病中的作用机制。

结果

1. 神经元分泌基线水平的 NfL：研究人员利用原代皮质、海马和背根神经节（DRG）神经元培养的条件培养基和细胞裂解物，发现 DRG 神经元在细胞裂解物中含有最高量的神经丝蛋白 NfL、NfM 和 NfH，而海马神经元和皮质神经元中的含量依次减少。在 24 小时内，分泌到培养基中的 NfL 蛋白量与细胞裂解物中表达的蛋白量模式相同，DRG 神经元分泌的 NfL 水平最高，皮质神经元最少。用 MAP3K12 / 双亮氨酸拉链激酶（DLK）抑制剂以及一系列促存活、抗凋亡和抗坏死化合物处理神经元培养物后，NfL 的释放没有显著变化，这表明神经元在正常稳态过程中会主动分泌基线水平的 NfL，而不仅仅在神经元功能障碍时分泌。
2. calpain 介导的蛋白水解是 NfL 释放所必需的：为研究调节 NfL 周转和释放的细胞机制，研究人员使用非选择性蛋白酶体抑制剂处理神经元，结果发现抑制蛋白酶体可诱导神经元应激，但细胞裂解物中的 NfL 水平不变，而 MG132 处理的神经元条件培养基中的 NfL 水平显著降低。由于 MG132 同时抑制蛋白酶体和 calpain，研究人员进一步使用特异性 calpain 抑制剂进行实验，发现 calpain 抑制剂可使培养基中分泌的 NfL 量减少 4 倍，与 MG132 处理的效果相似。而其他激酶抑制剂和自噬抑制剂等对 NfL 分泌没有影响，这表明 calpain 介导的蛋白水解是细胞在基线培养条件下释放 NfL 所必需的。
3. 神经元应激触发 calpain 蛋白水解和片段化 NfL 的释放：研究人员对海马神经元施加轻度兴奋性毒性应激（100 μM 谷氨酸处理 24 小时），发现培养基中分泌的 NfL 量增加了 2 倍，且与神经元变性程度（通过培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的释放来衡量）相关。用 JNK 抑制剂处理可阻断谷氨酸诱导的神经元死亡，并显著降低 NfL 释放。此外，calpain 抑制剂可剂量依赖性地保护 NfL 在细胞裂解物中的蛋白水解，减少 NfL 释放到培养基中，但对培养基中的 LDH 水平没有影响，这表明 calpain 活性在基线和应激条件下都是 NfL 释放所必需的。
4. NfL 卷曲螺旋区域是主要释放片段：通过算法预测，NfL 蛋白上有多个 calpain 切割位点，主要集中在 N 端。用谷氨酸或红藻氨酸处理培养的海马神经元后，发现神经元释放的主要 NfL 产物是约 40 - 45 kDa 的卷曲螺旋区域片段，以及少量约 13 kDa 的片段。通过免疫沉淀实验也证实了这一结果，且发现大部分释放的 NfL 是自由漂浮的，只有一小部分包含在细胞外囊泡中，表明大部分 calpain 处理的 NfL 是通过非囊泡机制从神经元分泌的。
5. NfL 缺失延迟 SOD1.G93A 小鼠症状发作：在 SOD1.G93A 小鼠模型中，疾病发作和进展过程中血浆 NfL 水平在 7 周和 17 周时出现双相升高。研究人员将 NfL 基因敲除（Nefl.KO）小鼠与 SOD1.G93A 小鼠杂交，发现 Nefl.KO 小鼠在 15 - 21 周时症状发作明显延迟，体重维持时间更长，尽管在生存率上没有显著改善，但在症状严重程度评分（ALS TDI 评分）上有显著优势。这表明遗传 NfL 缺失在 ALS 小鼠模型中具有有益作用。
6. NfL 缺失减少 SOD1.G93A 小鼠运动神经元丢失和微胶质细胞增生：对 15 周龄的小鼠腰椎脊髓进行分析，发现 SOD1.G93A x Nefl.KO 小鼠的运动神经元细胞体数量部分恢复，微胶质细胞的激活减少，表现为 Iba1 阳性信号总面积、聚类 Iba1 信号百分比以及微胶质细胞数量的减少，微胶质细胞的分枝指数也部分恢复到野生型动物的静息表型。这可能是 SOD1.G93A x Nefl.KO 小鼠症状延迟发作的原因。
7. 抗 NfL 抗体可阻断 NfL 驱动的微胶质细胞激活：研究人员生成了人重组全长 NfL（FL NfL）和截短的卷曲螺旋 NfL（CC NfL），发现两者都能被微胶质细胞吞噬，且 CC NfL 比 FL NfL 更易在溶酶体中积累。FL NfL 可诱导微胶质细胞产生 M1 型和 M2 型细胞因子，而 CC NfL 则不能。添加抗 NfL 抗体后，只有抗 N 端抗体能有效阻断 FL NfL 诱导的微胶质细胞细胞因子释放，这表明 FL NfL 可诱导培养的微胶质细胞产生促炎和抗炎反应，而抗 N 端 NfL 抗体可阻断这些反应。
8. 体内 NfL 暴露引发的转录组变化：向 11 周龄雄性小鼠海马双侧注射 FL NfL 或 CC NfL 后进行单细胞 RNA 测序（RNA-seq），发现微胶质细胞和巨噬细胞对 NfL 暴露有显著反应，表现为大量差异表达基因（DEGs）。对巨噬细胞进行亚聚类分析，发现 NfL 处理后，活化的巨噬细胞亚群（activated 0 - 3）显著增加，且 FL NfL 和 CC NfL 处理诱导的基因表达变化高度一致，基因集富集分析（GSEA）显示两者都显著富集了氧化磷酸化、MTORC1 信号通路和补体等相关通路，表明外源性 NfL 可导致单核细胞来源的巨噬细胞浸润到大脑并激活。
9. NfL 诱导的体内微胶质细胞激活基因特征：免疫组化（IHC）证实微胶质细胞在 FL NfL 注射后显著激活，且热灭活的 FL NfL 不能激活微胶质细胞，说明 FL NfL 的特定构象对激活至关重要。对微胶质细胞进行亚聚类分析，发现 NfL 处理后，微胶质细胞的活化亚群（activated 1 - 3）显著增加，且在多种神经退行性疾病小鼠模型（如 ALS、MS 和 AD）的微胶质细胞中，NfL 诱导的基因特征显著升高，在人类 MS 死后大脑的髓样细胞中也有类似现象，这表明 NfL 诱导的微胶质细胞基因特征与神经退行性疾病相关。

讨论

1. NfL 诱导体内微胶质细胞和巨噬细胞激活与炎症：炎症在神经退行性疾病的恶化中起重要作用，甚至可能是某些疾病的致病过程。本研究发现，细胞外 NfL 可导致髓样细胞炎症反应，包括细胞因子释放和形态变化。虽然在体外培养中微胶质细胞对 FL NfL 的细胞因子释放反应最明显，但在体内，FL NfL 和 CC NfL 都能导致免疫激活。这支持了在神经退行性疾病中，NfL 可能是免疫激活的触发因素之一的假设。研究人员还发现抗 NfL 抗体可在体外阻断髓样细胞对 FL NfL 的反应，这为治疗神经退行性疾病提供了潜在的策略，即通过阻断 NfL 激活髓样细胞来减轻炎症反应。然而，目前尚不清楚 NfL 激活免疫细胞的具体机制，如是否存在细胞外受体介导细胞因子释放等，需要进一步研究。
2. 研究的局限性：虽然 Nefl 基因敲除可改善 SOD1.G93A 动物的炎症，但神经退行性疾病中的炎症环境复杂，NfL 缺失可能对免疫系统有间接影响，如对 T 细胞的影响。此外，在已有损伤导致髓样细胞预激活或 T 细胞浸润的情况下，阻断 NfL 激活的效果可能不同，需要进一步研究。

资源可用性

本研究的进一步信息、资源和试剂请求可联系首席联系人 Casper C. Hoogenraad（[e-mail]）。研究中使用的试剂和资源在关键资源表中列出。RNA-seq 数据集已存入 Gene Expression Omnibus，分析脚本和代码可应要求提供。