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本文揭示了赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）修饰在 HIBCH 或 ECHS1 缺陷导致的线粒体和神经退行性病变中的关键作用。
### 赖氨酸甲基丙烯酰化修饰在 HIBCH 或 ECHS1 缺陷相关疾病中的作用
利氏综合征（Leigh syndrome）是一种严重的进行性神经退行性疾病，每 40,000 例活产婴儿中约有 1 例患病，通常在婴儿期或幼儿期发病，目前尚无治愈方法或有效的干预疗法。在多数患者中，呼吸链（尤其是复合物 I、II、IV 或 V）、辅酶 Q 或丙酮酸脱氢酶复合物的功能障碍是致病原因。而 3 - 羟基异丁酰辅酶 A 水解酶（HIBCH）和短链烯酰辅酶 A 水合酶（ECHS1）这两种在缬氨酸分解代谢中起关键作用的酶缺乏，也会导致罕见的利氏或利氏样综合征，但具体分子机制尚不明确。
HIBCH 和 ECHS1 均为线粒体蛋白，在缬氨酸分解代谢途径中，ECHS1 位于 HIBCH 的上游，催化甲基丙烯酰辅酶 A 转化为 3 - 羟基异丁酰辅酶 A，HIBCH 则将 3 - 羟基异丁酰辅酶 A 转化为游离的 3 - 羟基异丁酸。当 ECHS1 或 HIBCH 缺乏时，甲基丙烯酰辅酶 A 会发生积累。
研究发现，HIBCH 或 ECHS1 缺乏会影响线粒体形态。通过免疫荧光、亚细胞分级分离等实验表明，HIBCH 和 ECHS1 定位于线粒体基质。在 U2OS 细胞中进行 RNA 干扰（RNAi）敲低实验，发现 HIBCH 或 ECHS1 表达降低后，约一半细胞的线粒体出现碎片化和肿胀；利用 CRISPR - Cas9 技术构建的基因敲除（KO）细胞系，在正常培养条件下线粒体形态变化不明显，但在添加缬氨酸或使用半乳糖培养时，线粒体碎片化现象显著增加。进一步研究发现，这是由于线粒体融合相关蛋白 OPA1 的加工异常，L - OPA1 减少，S - OPA1 增加，而线粒体分裂相关蛋白 DRP1 和 FIS1 水平无明显差异。同时，过表达 OPA1 也无法挽救线粒体形态的变化。
HIBCH 或 ECHS1 缺乏还会影响线粒体活性。Seahorse XF Cell Mito Stress Test 检测显示，HIBCH 或 ECHS1 缺失会显著降低细胞的基础呼吸、ATP 生成、质子泄漏、最大呼吸和备用呼吸能力。在 ECHS1 KO 细胞中，电子传递链（ETC）复合物 I、II 和 III 的组装受损，部分复合物蛋白表达减少；而 HIBCH KO 细胞中，除复合物 II 组装增加外，未观察到明显的复合物组装缺陷。此外，HIBCH 或 ECHS1 缺失会导致细胞内活性氧（ROS）水平升高，补充 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）或维生素 E 可抑制 ROS 增加。
在果蝇模型中，缺失 Hibch 或 Echs1 会导致进行性神经退行性变和肌肉缺陷。利用 CRISPR - Cas9 技术构建的果蝇 KO 品系，在成年果蝇的眼睛和肌肉中进行研究发现，随着年龄增长，Hibch 或 Echs1 突变体果蝇眼睛中的小眼横纹数量减少，肌肉线粒体形态异常，ATP 生成减少，氧化应激反应增强。引入野生型基因可挽救眼睛退化表型，而携带疾病相关点突变的基因则不能完全挽救。
研究还发现，HIBCH 和 ECHS1 KO 细胞中存在异位 Kmea 修饰，这会导致线粒体形态变化。甲基丙烯酰辅酶 A 可修饰赖氨酸残基产生 Kmea 或其结构异构体赖氨酸巴豆酰化（Kcr）。在 HIBCH 和 ECHS1 KO 细胞中，Kmea 水平显著升高，而 Kcr 水平无明显变化。通过定量质谱分析鉴定出多个 Kmea 修饰的蛋白质，利用遗传密码扩展技术对部分蛋白质的赖氨酸位点进行修饰，发现 CH60（Hsp60）、FKBP4、BIP、LDHB 和 DHRS2 等蛋白的 Kmea 修饰会导致线粒体碎片化。阻断这些蛋白的 Kmea 修饰，如将 LDHB - K310 和 CH60 - K352 突变为精氨酸，可显著减少 ECHS1 KO 细胞的线粒体形态变化。
进一步研究发现，过表达 sirtuin 蛋白可降低 Kmea 修饰，部分逆转 HIBCH 或 ECHS1 缺陷导致的线粒体形态变化。SIRT2 可去除组蛋白上的 Kmea，哺乳动物中有 7 种 sirtuin 蛋白，其中 SIRT3、SIRT5 等在线粒体中发挥作用。在细胞和果蝇模型中，过表达 SIRT3、SIRT5、SIRT2 或 SIRT6 可降低 Kmea 水平，减少 KO 细胞中异常线粒体的比例，改善果蝇肌肉线粒体的异常。
给予 NAC 也可降低 Kmea 修饰，挽救 HIBCH 或 ECHS1 缺失导致的线粒体缺陷和神经退行性变。NAC 是半胱氨酸的前体药物和常用抗氧化剂，可消耗甲基丙烯酰辅酶 A，降低 Kmea 修饰水平。在细胞实验中，NAC 可部分挽救 HIBCH 或 ECHS1 KO 细胞的线粒体碎片化和 OPA1 加工缺陷；在果蝇实验中，NAC 可抑制年龄依赖性的眼睛退化和改善攀爬缺陷。
对人类患者来源的成纤维细胞研究发现，携带 HIBCH 或 ECHS1 突变的患者细胞中，Kmea 修饰增加，线粒体出现碎片化，给予 NAC 治疗可部分挽救这些缺陷。部分患者细胞的呼吸缺陷也可被 NAC 改善，甚至部分患者细胞在 NAC 治疗后最大呼吸和备用呼吸能力高于对照细胞。
尽管细胞和动物模型在 HIBCH 或 ECHS1 缺失时表现出相似缺陷，但仍存在差异。Kmea 修饰具有动态性，且 KO 细胞可能存在补偿效应。ECHS1 参与脂肪酸 β - 氧化，但在 Echs1 突变果蝇中未观察到明显的脂质滴积累。此外，甲基丙烯酰辅酶 A 如何运输出线粒体修饰胞质和核蛋白的机制尚不清楚。
NAC 作为一种 FDA 批准的药物和常用抗氧化剂，可能通过消耗甲基丙烯酰辅酶 A 和降低 Kmea 修饰发挥作用，但也可能与减轻氧化应激有关。维生素 E 虽能降低 ROS 水平，但不能改善 HIBCH 或 ECHS1 缺陷细胞的线粒体形态和果蝇的眼睛退化表型，表明单纯降低氧化应激可能不足以挽救相关缺陷，Kmea 修饰的降低可能更为重要。
本研究也存在一些局限性。目前尚不清楚哪些特定的蛋白质修饰在疾病发生中起主要作用，这些修饰的蛋白质是通过单一途径还是平行途径调节线粒体功能也有待研究。由于掺入效率的限制，无法直接研究这些修饰对线粒体功能的调节机制。此外，sirtuin 蛋白和 NAC 具有多种功能，观察到的有益效果可能不仅仅是 Kmea 修饰变化导致的。
综上所述，该研究揭示了 Kmea 修饰在 HIBCH 或 ECHS1 缺陷相关疾病中的重要作用，为利氏综合征的治疗提供了新的潜在方向，即降低 Kmea 修饰水平可能是治疗 HIBCH 或 ECHS1 相关利氏综合征的有效策略，但仍需进一步深入研究。
