Cell Reports：肠道共生菌诱导的 Duox-ROS 对维持围食膜结构稳态至关重要

本文揭示了昆虫肠道中 Duox-ROS 系统、围食膜（PM）和 Imd 途径的相互作用，对理解肠道免疫机制意义重大。

　　

一、研究背景

昆虫肠道作为内外环境的重要界面，栖息着大量有益微生物和食源性病原体。在长期进化过程中，昆虫形成了强大的黏膜宿主防御机制，其中物理和化学屏障以及诱导性反应起着关键作用。围食膜（PM）作为中肠物理屏障的前沿，是一种由几丁质和围食蛋白等蛋白质组成的网格状结构，类似于哺乳动物的黏液层，能够阻止细菌与肠道上皮细胞接触，同时允许营养物质和小分子通过。

昆虫肠道免疫中，经口摄入病原体可激活两种诱导性免疫反应：免疫缺陷（Imd）途径产生抗菌肽（AMPs），以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生活性氧（ROS）。其中，Duox 和 Nox 是 NADPH 氧化酶的重要成员，Duox 产生的 ROS 被认为具有杀菌作用，并能调节肠道微生物群，不过其具体功能还存在多种观点，例如刺激肠道肌肉收缩、促进上皮细胞更新等。此外，Imd 途径在识别革兰氏阴性菌和芽孢杆菌包膜中的二氨基庚二酸（DAP）型肽聚糖（PGN）后，会产生 AMPs 发挥免疫作用。

此前研究表明，ROS 和 AMPs 在抵御食源性病原体方面存在互补作用，且不同昆虫体内的免疫途径与 ROS 之间存在相互调节关系，但 Duox-ROS 系统对 Imd 途径的调控作用仍有待探索。本研究以桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）为研究对象，探究 Duox-ROS 与 Imd 途径在促进肠道有效防御中的相互作用机制。桔小实蝇肠道细菌群落丰富稳定，是研究宿主 - 免疫 - 微生物群相互作用的理想昆虫模型，同时它也是一种全球高风险检疫害虫，研究其肠道免疫机制对开发新型环保害虫防治技术具有重要意义。

二、研究结果

1. 口腔病原体感染后 Duox 和 Imd 途径激活的时间进程：研究人员给桔小实蝇喂食不同浓度的病原菌雷特氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri），并检测 Duox 和 Imd 途径激活的时间表达谱。结果发现，在高浓度（光密度 600 [OD₆₀₀]=50）感染时，Duox基因在感染后 3 小时（hpi）被激活，同时 H₂O₂水平略有上升，而 Imd 途径在 6 hpi 激活，表现为 AMPs 基因如Dpt和AttA的表达上调。在低浓度（OD₆₀₀=15）感染时，Duox基因在 6 hpi 上调，Imd 途径则在 48 hpi 激活。这表明 Imd 途径和Duox表达在病原体感染时均被激活，且 Imd 途径的激活动力学比Duox基因表达慢。

2. 改变肠道 ROS 水平对 Imd 途径激活的影响：为探究Duox早期激活对 Imd 途径的影响，研究人员通过注射双链 RNA（dsRNA）沉默Duox以降低 ROS 水平。结果显示，在高剂量P. rettgeri感染时，Duox RNAi 果蝇的 Imd 途径更早激活，Dpt和AttC基因在 3 hpi 就显著上调，而对照组在 6 hpi 才启动免疫反应。在低剂量感染时，对照组在 3、6、9 hpi 均未观察到 Imd 途径激活，而Duox RNAi 果蝇在 9 hpi 时，Imd 途径靶基因Dpt、AttA和AttB的诱导更早且更强。此外，用抗氧化剂维生素 C 和 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理果蝇以降低 ROS 水平，同样能刺激 Imd 途径在 9 hpi 更早更强地激活。这些结果表明，ROS 可影响 Imd 途径的免疫反应性，ROS 耗竭会增加 Imd 途径的免疫反应性，导致更快更强的免疫激活。

进一步研究发现，Duox RNAi 果蝇肠道内P. rettgeri负载增加，但用抗氧化剂预处理果蝇并未改变低剂量感染时的细菌负载，且在喂食热灭活的P. rettgeri时，Duox RNAi 果蝇和抗氧化剂处理果蝇仍能诱导 Imd 途径激活，这表明 Imd 免疫活性的增加并非由P. rettgeri负载增加所致，而是肠道 ROS 水平降低本身导致的。3. 降低肠道 ROS 水平对 PM 通透性的影响：研究人员对Duox RNAi 和egfp RNAi 对照果蝇的全肠道进行转录组分析，发现Duox RNAi 果蝇中 364 个基因差异表达，其中Peritrophin-48基因显著下调。RT-qPCR 分析证实，Duox RNAi 果蝇肠道中 H₂O₂水平显著降低后，Peritrophin-48表达也大幅下降。Peritrophin-48是多种果蝇 PM 的关键结构成分，通过透射电子显微镜（TEM）分析发现，在桔小实蝇中，PM 由 3 层（PM1、PM2 和 PM3）构成，与采采蝇相似。Peritrophin-48基因敲低后，PM1 厚度显著减小，PM2 和 PM3 结构受损，导致肠道细菌进入外质膜空间（PM 与肠道上皮细胞之间）。通过喂食荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖分子检测 PM 通透性，发现Peritrophin-48 RNAi 果蝇中，葡聚糖信号扩散到外质膜空间，而对照组则保留在肠腔中，这表明 Peritrophin-48 维持着 PM 结构的完整性，进而推测 Duox 可能通过影响 PM 通透性来影响 Imd 途径。4. H₂O₂和 Duox 对 PM 形成的作用：TEM 结果显示，在标准条件下，Duox -RNAi 处理的果蝇 PM1 厚度显著减小，PM2 和 PM3 结构受损，FITC - 葡聚糖喂食实验也表明其肠道 PM 通透性增加，这表明 ROS 在 PM 形成中起作用。抗氧化剂处理清除肠道 ROS 后，同样导致Peritrophin-48表达下降、PM1 厚度减小、PM2 和 PM3 受损以及 PM 通透性增加。补充生理浓度（600 μmol/L）的 H₂O₂可挽救Duox RNAi 果蝇的 PM 缺陷和 Imd 诱导水平，证明了 ROS 和 Duox 对 PM 屏障完整性的关键作用。

此外，Peritrophin-48 RNAi 果蝇在口服低浓度P. rettgeri感染后，Dpt和AttA表达更高，表明Duox通过促进Peritrophin-48的表达来调节 PM 通透性和 Imd 途径的免疫反应。5. H₂O₂对Tace激活及 PM 基因表达的调控：在哺乳动物气道上皮细胞中，ROS 可激活肿瘤坏死因子 α 转换酶（Tace），调节粘蛋白表达。由于昆虫 PM 与哺乳动物粘蛋白有许多相似之处，研究人员探究 H₂O₂对桔小实蝇Tace表达的影响。结果发现，Duox RNAi 和抗氧化剂处理的果蝇中，Tace表达水平显著下降，去除肠道微生物群也会降低Duox表达、肠道 ROS 含量和Tace基因表达，而补充生理浓度的 H₂O₂可挽救Duox RNAi 果蝇的Tace基因表达，这表明 Duox 产生的 H₂O₂对肠道中Tace的表达是必需的。

进一步研究发现，Tace沉默会导致Peritrophin-48基因下调，TEM 结果显示Tace -RNAi 果蝇的 PM1 厚度显著减小，PM 通透性增加，Imd 途径活性在口服低剂量P. rettgeri感染时增强，这表明 Duox 产生的 H₂O₂可通过Tace调节 PM 的形成。6. 肠道 H₂O₂水平升高对 PM 的影响：研究发现，口服高剂量P. rettgeri（OD₆₀₀=50）感染果蝇的肠道 H₂O₂水平是未感染果蝇的三倍，达到 1800 μmol/L。高浓度的 H₂O₂会对 PM 造成损害，TEM 数据显示，感染高剂量P. rettgeri或喂食高浓度 H₂O₂ 6 小时的果蝇，PM1 层厚度显著减小，只有 20 kDa 的葡聚糖信号能扩散到外质膜空间，表明 PM 结构受损。同时，PM 蛋白羰基化水平增加，这是 ROS 导致 PM 氧化损伤的表现。长期喂食低浓度P. rettgeri（OD₆₀₀=15） 48 小时，也会因 H₂O₂积累导致 PM 结构损伤、PM1 层厚度减小和 PM 蛋白羰基化水平增加。

研究人员还发现，用高浓度 H₂O₂和P. rettgeri（OD₆₀₀=15）共同感染果蝇，Imd 靶基因Dpt、AttB和AttC显著上调，尽管此时肠道内P. rettgeri负载略有降低，但仍能诱导 Imd 激活，这表明 H₂O₂导致的 PM 损伤会增强 Imd 途径的活性。7. 微生物群对 PM 通透性的调节作用：肠道共生菌可刺激果蝇 Duox 介导的 ROS 产生，研究人员探究其对桔小实蝇 PM 结构的影响。结果发现，抗生素处理降低了桔小实蝇的 H₂O₂水平，导致Peritrophin-48基因表达下降、PM 结构改变（PM1 层厚度显著减小，PM 通透性增加），Imd 途径活性在口服低剂量P. rettgeri感染时增强。补充肠道共生菌可恢复 H₂O₂水平、Peritrophin-48基因表达和 PM 结构，降低 Imd 途径活性。补充生理浓度的 H₂O₂也能达到类似效果，这表明微生物群通过影响 Duox 产生的 ROS 来调节 PM 完整性，进而影响 Imd 途径的免疫反应性。此外，PM 结构破坏会导致肠道上皮细胞受损，而无微生物群时肠道上皮细胞结构正常，说明 PM 还能保护宿主免受微生物群造成的损伤。

三、讨论

1. Duox 产生的 ROS 对 PM 通透性的调节：本研究表明，Duox 产生的 ROS 通过Tace维持 PM 完整性。此前研究虽表明 ROS 是抵御微生物的有效屏障，但具体机制不明。本研究进一步揭示了 Duox 在肠道免疫中的新作用，Duox RNAi 会增加 PM 通透性，使宿主对细菌感染更敏感，而补充生理浓度的 H₂O₂可挽救这一表型。

在双翅目昆虫中，PM 在中肠前部通过复杂过程产生，其形成机制尚不清楚。本研究发现 ROS 通过调节 PM 蛋白的转录合成来调节 PM 屏障完整性，Duox 产生的 ROS 调节Tace基因表达，进而影响Peritrophin-48表达。不过，Tace诱导Peritrophin-48表达的具体机制仍不明确，推测可能与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径有关，需进一步实验验证。此外，本研究发现 Duox 介导的 ROS 在转录水平调节Tace活性，与之前报道的 Duox 衍生的 ROS 直接参与 Tace 酶激活不同。

同时，研究还发现 ROS 对 PM 的作用具有剂量依赖性，低剂量时促进 PM 形成和维持，高剂量时则通过蛋白质羰基化破坏 PM。这种精细调节由肠道共生菌实现，肠道微生物通过刺激 Duox 维持肠道 ROS 稳态，进而调节 PM 形成。2. PM 通透性对 Imd 途径免疫反应性的调节：多种机制调节肠道 Imd 途径的免疫反应性，本研究发现 PM 改变可迫使 Imd 途径改变反应性。在其他昆虫模型中也有类似现象，如采采蝇抑制 PM 产生会导致感染时 Imd 途径更早激活，果蝇Drosocrystallin突变体中 PM 结构稳定性破坏会增加 Imd 途径活性。研究推测，当 PM 这一物理屏障被 ROS 或病原体破坏时，大量病原体相关分子模式（PAMPs）进入外质膜空间，迫使 Imd 途径启动强大的免疫反应来抵御病原体入侵，这表明 PM 不仅是物理屏障，还在决定免疫反应性方面发挥重要作用。

本研究还揭示了口服P. rettgeri感染时 Duox 和 Imd 途径的顺序激活，Duox启动即时防御反应，Imd 途径随后启动。类似的顺序激活在果蝇幼虫中也有报道，早期激活的Duox可通过诱导括约肌收缩将病原菌隔离在中肠前部，随后激活的 Imd 途径对杀死被困细菌和确保幼虫存活至关重要。此外，抗氧化剂处理组细菌负载较低，可能是因为维生素 C 和 NAC 对细菌生长有抑制作用，同时Duox可能在感染后被激活，与 Imd 途径共同对抗病原体增殖。研究还表明，Imd 途径的晚期激活与高 ROS 水平导致的 PM 损伤有关。

总体而言，本研究揭示了 ROS 水平与 AMPs 产生之间的关联机制：共生菌诱导 Duox 产生的低 ROS 水平维持 PM 完整性，使 Imd 途径激活水平较低；病原体诱导的高 ROS 水平破坏 PM，增强 Imd 反应。这种机制将强烈的 Imd 途径激活限制在病原体感染时，避免其慢性激活对肠道造成有害影响，如导致菌群失调。本研究揭示了昆虫肠道免疫反应中 Duox、Imd 和 PM 之间的复杂相互作用，推动了对昆虫整体免疫机制的理解。3. 研究的局限性：本研究未明确Tace影响Peritrophin-48基因表达的具体机制，虽推测可能与 MAPK 途径有关，但需进一步验证。此外，肠道是高度区域化的器官，未来研究 PM 如何参与肠道区域化内微生物稳态的调节具有重要意义。

四、资源可用性

1. 主要联系人：进一步的信息以及资源和试剂的请求应联系主要联系人 Hongyu Zhang（[e-mail]）。

2. 材料可用性：本研究未产生新的独特试剂。

3. 数据和代码可用性：桔小实蝇肠道 RNA 测序数据已存入 SRA 数据集，自发表之日起可公开获取，登录号列于关键资源表中。本文未报告原始代码，如需重新分析本文数据所需的任何其他信息，可向主要联系人索取。