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本文发现文昌鱼的 Vent 基因具有 Nanog 样编程活性，为多能性的进化起源提供新见解。
研究背景
多能性指胚胎细胞分化为体细胞和原始生殖细胞（PGCs）的能力，其相关基因在真兽类哺乳动物中高度保守，但在其他类群中研究困难，原因在于基因序列保守性差和基因重复导致直系同源基因难以鉴定。Nanog 基因是哺乳动物多能性的关键调节因子，对维持胚胎干细胞（ESC）的自我更新、体细胞重编程以及胚胎发育至关重要，但在非哺乳动物中的作用尚不明确，且在脊椎动物以外未发现其直系同源基因。此前有研究推测 Nanog 可能起源于 Bsx、Nkx 或 Ventx 基因家族，但未得到功能验证。因此，探究 Nanog 的前体基因及其在多能性编程中的作用，对理解多能性的进化起源具有重要意义。
实验设计
- 筛选具有 Nanog 样活性的 Vent 基因：通过系统发育分析，筛选出代表后生动物进化特定阶段的无脊椎动物 Vent 基因，在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中过表达这些基因，检测其在白血病抑制因子（LIF）撤出后维持干细胞干性的能力。同时，利用 Nanog 基因敲除的神经干细胞来源的前诱导多能干细胞（NnNpiPSCs），测试无脊椎动物 Vent 基因的重编程能力。
- 分析 Vent 基因的表达模式：运用原位杂交（ISH）和单细胞 RNA 测序（RNA-seq）技术，研究在文昌鱼（Saccoglossus kowalevskii）和海葵（Nematostella vectensis）中 Vent 基因的表达情况，以了解其在胚胎发育过程中的时空表达模式。
- 探究 Vent 基因功能及机制：构建包含不同 Vent 基因结构域的融合蛋白，转导 NnNpiPSCs，分析其重编程效率和细胞命运变化。通过对氨基酸序列进行定点突变，确定赋予 NvVent 完全重编程活性所需的最小氨基酸变化，并借助计算机模拟结构分析，探讨这些变化对蛋白质功能的影响。在墨西哥钝口螈（axolotl）胚胎中进行实验，研究 Vent 基因在体内的功能，包括对胚胎发育、中胚层形成和生殖细胞特化的影响。
实验结果
- 古老 Vent 基因具有 Nanog 样作用：系统发育分析表明，脊椎动物的 Nanog 和 Ventx 基因共享一个 Vent 样祖先。在 mESCs 中过表达实验发现，文昌鱼的 SkVent1-WR、SkVent2-WR 和海葵的 NvVent-WR 能够在 LIF 撤出后支持碱性磷酸酶（AP）阳性集落的生长，而脊椎动物的 Vent 基因和海绵的 EfVent-WR 则不能，这表明维持多能性的能力在原始后生动物的 Vent 基因中已经存在，但在脊椎动物 Vent 基因复制后丢失，进而产生了 Nanog 基因。
- 无脊椎动物 Vent 基因的重编程能力：在 NnNpiPSCs 重编程实验中，SkVent2-WR 能够介导稳定的细胞重编程，尽管效率低于 Nanog 基因。NvVent-WR 表现出部分重编程活性，诱导形成类似 XEN 细胞的细胞，但这些细胞无法在 2i + LIF 条件下存活。进一步研究发现，NvVent 诱导的细胞具有 XEN 细胞的特征，且其存活依赖于细胞外信号调节激酶（ERK），这表明 NvVent 可启动重编程过程，但无法建立稳定的多能性。
- Vent 基因的表达特征：ISH 显示，文昌鱼的 SkVent1 和 SkVent2 在早期发育阶段的表达模式与脊椎动物的 Nanog 相似，在早期原肠胚阶段，两者均在推定的外胚层细胞中表达，随后表达逐渐消失。海葵的 NvVent 表达模式则不同，它在胚胎的多个细胞层中广泛表达，包括外胚层、内胚层和中胚层，以及一些未鉴定的免疫细胞群体和神经祖细胞簇中的部分细胞。
- 赋予海葵 Vent 基因 Nanog 样活性：通过交换 SkVent2 和 NvVent 的同源结构域（HD）实验表明，SkVent2 的 HD 赋予了融合蛋白将 NnNpiPSCs 重编程为多能状态的能力，而 NvVent 的 HD 则不能。对 NvVent 的 HD 进行氨基酸突变，发现改变 3 个氨基酸（ModNvV - 1）可使其获得部分重编程活性，改变 4 个氨基酸（ModNvV - 2）可显著提高重编程效率，且这些重编程细胞能够激活内源性多能性基因。结构分析显示，这些氨基酸变化位于 DNA 结合区域之外，可能通过招募其他多能性因子发挥作用。此外，海葵中与 Esrrb 类似的基因 NvEsrrbl 能够成功重编程 NnNpiPSCs，激活内源性多能性基因，这表明核心多能性基因网络的元件在元古代胚胎中已经存在。
- SkVent2 可指定脊椎动物生殖系 competent 中胚层：在墨西哥钝口螈胚胎中，Nanog 基因敲低（KD）会导致胚胎发育在原肠胚形成前完全停滞，而注射 SkVent2 的 mRNA 能够挽救这一表型，NvVent 则无此作用。VENTX 敲低会导致墨西哥钝口螈胚胎的后腹侧区域发育异常，包括中肾管缺失和后腹侧侧板中胚层减少。进一步研究发现，VENTX 在生殖系 competent 中胚层的特化中起关键作用，SkVent2 和人类的 HVentX 能够挽救 VENTX 敲低导致的生殖细胞标记基因和中胚层标记基因表达异常，而 NvVent 只能部分挽救体细胞基因的表达，无法挽救生殖细胞标记基因的表达。
研究结论
- 多能性编程能力的进化：本研究表明，无脊椎动物 Vent 基因家族具有编程多能性的能力，这种能力在双侧对称动物祖先中已经出现。SkVent2 能够将体细胞重编程为多能状态，NvVent 具有部分重编程活性，且通过对其氨基酸序列的修饰可赋予其更强的重编程能力。这一发现揭示了多能性编程能力在进化过程中的保守性和演变。
- 与中胚层进化的关联：NANOG 活性的出现与中胚层的进化密切相关。SkVent2 能够挽救 NANOG - KD 墨西哥钝口螈胚胎的发育缺陷，促进中胚层细胞类型的形成，这表明 NANOG 活性的进化可能为早期胚胎细胞形成中胚层和其他脊索动物特有的细胞类型提供了能力，推动了动物发育过程中细胞多样性的增加。
- 研究的局限性与展望：尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，在不同两栖动物物种中，Vent 基因的功能存在差异，需要进一步深入研究以明确其功能重叠情况。此外，Vent 基因在其原生生物中的精确作用尚未完全明确，对其在生殖细胞形成中的机制了解也较少。未来的研究需要扩大物种采样范围，开展更多在原生生物中的功能研究，以及进行直接的生化和结构验证，以进一步完善对多能性进化及其在元古代动物发育中作用的理解。}
