ZEB1 转录因子调控黑色素瘤细胞 PD-L1 表达，揭示免疫逃逸新机制

为探究黑色素瘤免疫逃逸机制，研究人员研究 ZEB1 对肿瘤细胞 PD-L1 表达的调控，发现 ZEB1 可促进 PD-L1 表达，为治疗提供新思路。

　　在癌症的 “战场” 上，肿瘤细胞为了 “存活” 和 “扩张领地”，会想尽各种办法逃避人体免疫系统的 “追捕”。其中，免疫检查点蛋白 PD-L1（程序性死亡配体 1）就像是肿瘤细胞的 “护盾”，当它与免疫细胞上的 PD-1（程序性死亡受体 1）结合，就会抑制免疫细胞的活性，让肿瘤细胞得以逍遥法外。在黑色素瘤的治疗中，免疫检查点阻断（ICB）疗法，比如使用抗 PD-1 抗体，虽然给很多患者带来了希望，能让大约 40% 的患者获得临床益处，但大多数患者还是会出现原发性或获得性耐药，这让医生们十分头疼。而且，PD-L1 的表达还与患者较低的总生存率相关，因此，搞清楚黑色素瘤细胞中 PD-L1 表达的调控机制，就成了攻克黑色素瘤的关键。

来自法国的研究人员针对这一难题展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》杂志上，为我们理解黑色素瘤的免疫逃逸机制带来了新的曙光。

为了开展研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们培养了多种细胞系，包括 A375 人黑色素瘤细胞系以及患者来源的短期培养细胞系 GLO 和 C-09.10 等。通过免疫印迹分析（Immunoblot analyses）检测细胞中相关蛋白的表达水平；利用实时定量 PCR（RT-qPCR）测定 RNA 的表达量；采用流式细胞术（Flow cytometry analyses）分析细胞表面标志物的表达；借助染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation）技术研究蛋白与 DNA 的相互作用；还对人体原发性黑色素瘤样本进行了多色免疫荧光多重分析（Seven-color immunofluorescence multiplex analyses）和单细胞 RNA 测序（Single-cell RNA-seq） 等。研究用到的人体肿瘤样本来自法国里昂南部医院的生物资源中心，均获得了患者的书面知情同意，并经过当地伦理委员会和法国数据保护机构的批准。

下面来看看具体的研究结果：

• 表型转换与 PD-L1 表达的关联：研究人员发现，除了 ZEB1（锌指 E 盒结合蛋白 1）过表达，用 TNFα（肿瘤坏死因子 α）联合或不联合 TGFβ（转化生长因子 β）处理黑色素细胞患者来源的短期培养物，可诱导细胞向侵袭性 / 神经嵴样状态表型转换。在这个过程中，ZEB1 和 NGFR（神经生长因子受体）表达增加，MITF（小眼畸形相关转录因子）表达降低。同时，通过流式细胞术检测发现，在 GLO 和 C-09.10 细胞系中，经 TNFα ± TGFβ 处理以及 ZEB1 过表达的 C-09.10 细胞，其细胞膜上 PD-L1 的表达显著增加，且表达 PD-L1 的细胞同时也表达 NGFR。此外，对黑色素瘤细胞系的单细胞 RNA 测序公共数据集分析显示，在间充质样黑色素瘤细胞中，PD-L1 和 ZEB1 的表达均增加。
• ZEB1 对 CD274 启动子的作用：研究人员在之前的 ZEB1 染色质免疫沉淀测序数据集中发现，ZEB1 会结合到 CD274（PD-L1）启动子的转录起始位点。通过 ChIP-QPCR 实验进一步验证了在 A375 细胞和经 TNFα 处理的 GLO 细胞中，ZEB1 与 PD-L1 启动子的结合，且富集水平与作为阳性对照的 MITF 启动子相似。这表明 ZEB1 可能通过结合 PD-L1 启动子促进其转录激活。后续实验也证实，在 TNFα 处理的 C-09.10 和 GLO 细胞中，PD-L1 mRNA 表达增加；在 ZEB1 过表达的 C-09.10 细胞中，PD-L1 mRNA 表达有增加趋势，而在 ZEB1 敲除的 A375 细胞中，PD-L1 mRNA 表达下降了 40%。这一系列实验充分证明 ZEB1 能结合到 PD-L1 启动子并直接诱导其转录，使得细胞膜上 PD-L1 表达显著增加。
• 人体原发性黑色素瘤样本中 ZEB1 与 PD-L1 的关系：由于肿瘤样本的批量 RNA 测序分析会受到免疫细胞和基质细胞表达的干扰，无法准确研究肿瘤细胞特异性表达。研究人员设计了一种多重免疫荧光检测方法，用 SOX10 区分肿瘤细胞和基质组织，用 CD68 识别巨噬细胞，精确研究人体原发性黑色素瘤样本中 ZEB1 和 PD-L1 在肿瘤细胞中的表达相关性。结果发现，PD-L1 主要在肿瘤结节周边或与浸润肿瘤的 CD68 + 细胞紧密相关的肿瘤细胞中表达，且 PD-L1 表达主要存在于高表达 ZEB1 的肿瘤细胞中。在所有肿瘤中，15% 的 ZEB1 阳性细胞 PD-L1 呈阳性，而 ZEB1 阴性细胞中这一比例仅为 4.21%。将肿瘤分为 ZEB1^high和 ZEB1^low两组后发现，ZEB1^high肿瘤中的 PD-L1 肿瘤细胞表达显著高于 ZEB1^low肿瘤，并且肿瘤细胞中 ZEB1 表达与 PD-L1 表达存在显著相关性。

综合研究结果和讨论部分来看，肿瘤细胞表达抑制性免疫检查点配体是逃避免疫监视的主要机制之一，肿瘤细胞可塑性也被越来越多地认为是免疫逃逸的内在机制。此次研究首次证实 ZEB1 直接结合到 CD274 启动子，诱导 PD-L1 mRNA 转录并增加其在细胞膜上的表达，这为解释 ZEB1 如何促进免疫逃逸提供了新的机制。虽然 PD-L1 与黑色素瘤患者对免疫治疗的反应有关，但它单独作为预测标志物并不充分，且目前检测 PD-L1 表达的方法也不统一。不过，该研究通过精确研究 PD-L1⁺肿瘤细胞的空间定位及其与 ZEB1 表达的共定位，发现二者在原发性肿瘤样本中有优先关联，这为未来研究 ZEB1/PD-L1 黑色素瘤细胞异质性与免疫治疗反应的关系奠定了基础，有望为黑色素瘤的治疗开辟新的方向。