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研究人员开发多重实时 PCR 检测人乳头瘤病毒（HPV）15 种基因型，灵敏度 98%、特异性 100%，助力 HPV 筛查。
宫颈癌，这个 “女性健康杀手”，长期以来在全球范围内尤其是医疗资源匮乏的欠发达地区肆虐。据了解，约 70% 的宫颈癌都和人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）的 16 型和 18 型感染脱不了干系。HPV 就像个 “隐形的敌人”，在全球范围内广泛传播，截至目前，已发现 225 种 HPV 类型，其中 12 种高危型和 3 种可能的高危型是导致恶性病变的 “罪魁祸首”。虽然 HPV 疫苗和筛查项目在一定程度上控制了病情，但受限于高昂的成本、复杂的操作流程，以及部分地区疫苗接种和筛查的普及度低，宫颈癌依旧是公共卫生领域的重大难题。因此，寻找一种高效、低成本的 HPV 检测方法迫在眉睫。
在此背景下，伊朗医科大学（Iran University of Medical Sciences）细胞与分子研究中心以及医学系生物技术部门的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种多重实时聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测方法，以快速、准确地识别 15 种高危和可能高危的 HPV 基因型。研究成果发表在《Infectious Agents and Cancer》杂志上，为 HPV 的筛查和防治带来了新的曙光。
为了实现这一目标，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，样本来自伊朗德黑兰医学诊断实验室的拭子标本，提取 DNA 后，用商业试剂盒进行 HPV 基因分型。接着，从 NCBI 数据库获取相关基因序列，用 Allele ID 软件设计引物和探针，针对不同基因型分别设计特异性或通用的引物和探针，并标记不同荧光基团。之后，通过单重 PCR 优化引物和探针浓度、退火温度；在此基础上进行多重 PCR，评估检测性能。同时，用多种潜在干扰样本评估分析特异性，通过制备系列稀释样本确定分析灵敏度（检测限，Limit of Detection，LOD），最后用商业试剂盒对比检测临床样本，计算临床灵敏度和特异性。
研究结果如下：
- 优化结果：在对引物和探针浓度进行优化时发现，当正向和反向引物浓度为 3pM、探针浓度为 1pM 时，平均循环阈值（Cycle Threshold，Ct）值最低；而在测试不同退火温度后，确定 60°C 为最佳退火温度，此时扩增效果最佳。
- 多重 PCR 性能：将优化后的条件应用于多重 PCR，结果显示其与单重 PCR 结果基本一致。不过，由于引物间存在竞争，多重 PCR 的灵敏度略有下降，Ct 值稍高。最终确定多重 PCR 的优化条件为引物 3pM、探针 1pM、退火温度 60°C。
- 分析特异性：经过计算机模拟分析（in silico analysis）和体外实验验证，该检测方法对包括常见低风险基因型 HPV 6 和 11、腺病毒 2、单纯疱疹病毒、HIV、HBV、HCV 等在内的多种潜在干扰样本均无交叉反应，展现出良好的特异性。
- 分析灵敏度：通过对各 HPV 基因型进行系列稀释并检测，发现该方法的检测限为 10 copies/μL，即在此浓度下，能保证 95% 以上的重复测试产生阳性结果。
- 临床灵敏度和特异性：研究人员对 190 份 DNA 样本（150 份 HPV 阳性、40 份 HPV 阴性）进行检测，新开发的实时 PCR 方法与商业试剂盒的检测结果高度一致（kappa = 0.9884）。其临床特异性达到 100%，临床灵敏度为 98%，仅 2 例结果存在差异，且均与 HPV 59 和 HPV 68 相关。
在研究结论和讨论部分，该多重实时 PCR 检测方法展现出诸多优势。它能够在一次反应中同时检测 15 种高危和可能高危的 HPV 基因型，大大提高了检测效率，降低了检测成本。与传统检测方法相比，这种方法灵敏度高、特异性强，即使在资源有限的环境下也能准确检测 HPV 感染。不过，研究也存在一定局限性，例如仅能特异性检测 HPV 16 和 18 型，其余 13 种菌株未进一步区分，且样本量受限，缺乏患者信息和长期随访数据。
总体而言，这项研究开发的多重实时 PCR 检测方法为 HPV 筛查提供了一种高效、经济且准确的工具。它能够帮助医疗工作者更及时、精准地发现 HPV 感染，对宫颈癌等 HPV 相关疾病的早期诊断和防治具有重要意义，有望在全球范围内推动 HPV 防控工作的进一步发展。未来，期待更多研究能够扩大样本量，补充详细的患者信息，深入探究 HPV 基因型与病变发展之间的关系，为女性健康保驾护航。
