内源性 TDP-43 错定位小鼠模型揭示疾病新机制与潜在治疗方向

为研究肌萎缩侧索硬化（ALS）等疾病早期病理，研究人员构建小鼠模型，发现致病机制，为治疗提供新思路。

　　在神经科学的神秘领域中，肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia，FTD）等神经退行性疾病，一直是困扰科学界的难题。这些疾病的发生，往往与 TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）的病理变化紧密相关。TDP-43 在正常情况下，维持着细胞内的各种生理平衡，但在 ALS 和 FTD 患者体内，它却像脱缰的野马，出现错定位和聚集现象，成为破坏神经元的 “元凶”。

现有的转基因动物模型，大多只能聚焦于 TDP-43 蛋白病的晚期阶段，对于疾病早期、症状出现前的运动神经元特异性病理变化，却无能为力。就好比我们只能看到疾病发展的 “果”，却难以探寻其 “因”。为了填补这一空白，深入了解疾病的早期进程，来自美国休斯顿卫理公会研究所（Houston Methodist Research Institute）等机构的研究人员踏上了探索之旅，他们构建了一种全新的内源性敲入（KI）小鼠模型，相关研究成果发表在《Acta Neuropathologica Communications》上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过 CRISPR/Cas9 和 FLEX Cre-switch 策略，精准地对小鼠的 Tardbp 基因进行编辑，构建出表达 Tdp-43?NLS 变体的小鼠模型。接着，利用免疫印迹（IB）技术，对蛋白质进行分析，了解其表达水平和修饰状态；通过免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）染色，直观观察蛋白质的定位和细胞内的病理变化；借助彗星实验、长扩增 PCR（LA-PCR）等实验，评估 DNA 损伤情况。此外，还运用行为学测试，如 Rotarod 实验、Hindlimb-clasping 测试和 DigiGait treadmill 测试，来评估小鼠的运动功能。

研究结果令人瞩目。在细胞实验中，研究人员构建的多西环素诱导的 SH-SY5Y 细胞模型显示，与野生型 TDP-43 相比，NLS 突变的 hTDP-43 mNLS 表达会导致核内 TDP-43 缺失，同时 γH2AX 焦点形成显著增加，DNA 双链断裂（DSBs）积累。这表明 TDP-43 核定位信号的失活会引发基因组不稳定，为后续研究奠定了基础。

在小鼠模型的构建上，研究人员成功建立了两种不同的小鼠模型，即全身（WB）和运动神经元（MN）特异性表达 Tdp-43?NLS 的小鼠模型。通过对这些小鼠的研究发现，Tdp-43?NLS 的表达会诱导 TDP-43 在中枢神经系统（CNS）中错定位和聚集。在 MN-Tdp-43?NLS 小鼠的大脑皮层中，超过 50% 的 Map2 阳性神经元出现胞质 TDP-43 错定位，同时伴有神经元核变形和 Map2 表达降低。并且，该模型小鼠的蛋白质聚集水平显著增强，淀粉样斑块形成增多，这一系列变化都暗示着 MND 病理的存在。

进一步研究发现，Tdp-43 蛋白病对运动功能产生了显著影响。MN-Tdp-43?NLS 小鼠在尾巴悬挂测试中表现出异常的后肢反应，体重变化也暗示着代谢失调。在肌肉组织中，TDP-43 及其磷酸化形式的高分子量形式增加，单体形式减少，同时肌肉纤维蛋白 Titin 和神经肌肉接头相关蛋白 Stmn2 的水平也发生了改变。行为学测试结果显示，12 个月大的 MN-Tdp-43?NLS 小鼠在 Rotarod 测试中的跌落潜伏期显著缩短，步态对称性异常，后肢 paw 面积、stance-to-swing 比和 stride 长度等参数也与对照组存在明显差异，这些都表明小鼠出现了肌肉萎缩和步态畸形。

从分子机制层面来看，Tdp-43 错定位与神经元基因组损伤密切相关。在 12 个月大的 MN-Tdp-43?NLS 小鼠的大脑皮层中，DSB 标记 γH2ax 的表达约为对照组的四倍，TUNEL 分析也证实了基因组损伤水平的显著升高。并且，错定位的 Tdp-43 会将 DNA 修复因子 XRCC4 和 DNA 连接酶 4（Lig4）隔离在神经元的细胞质中，导致 DNA 损伤和修复受损。这一发现揭示了 TDP-43 病理与 DNA 损伤之间的重要联系。

此外，受损的 DNA 修复还与神经炎症和神经元衰老相关。在 MN-Tdp-43?NLS 小鼠的 CNS 中，激活的小胶质细胞和星形胶质细胞数量显著增加，炎症标记物 Il-6 和 Tnf-α 的表达也明显上调，这表明内源性 Tdp-43 错定位相关的蛋白质聚集能够诱导炎症反应。同时，在小鼠的大脑皮层和后肢比目鱼肌组织中，衰老细胞的比例显著增加，衰老相关标记基因 Edn1、p21 和 Ankrd1 的表达也大幅升高，这表明 Tdp-43?NLS 变体的表达会导致神经元衰老和肌肉组织的变化。

综合研究结论与讨论部分，该研究构建的新型内源性 Tdp-43?NLS 小鼠模型，成功模拟了 ALS 的早期阶段，展现出 TDP-43 错定位、聚集、神经退行性变等关键病理特征。这一模型克服了以往模型的局限性，为深入研究 ALS 和 FTD 的发病机制提供了有力工具。研究揭示了 TDP-43 病理与 DNA 损伤、神经炎症和神经元衰老之间的紧密联系，为开发针对 TDP-43 病理相关神经退行性疾病的 DNA 修复靶向治疗方法提供了新的思路和潜在靶点。未来，有望基于这一模型，进一步探索疾病的早期干预措施，为攻克这些神经退行性疾病带来新的希望。