利用工程化人树突状细胞诱导的细胞毒性淋巴细胞介导强效抗白血病活性

为改善急性髓系白血病（AML）治疗，研究人员用工程化人树突状细胞诱导 CTLs，发现其体外和体内均有抗白血病活性。

　　急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一种极具破坏力的血液癌症，如同隐藏在血液中的 “恶魔”，无情地侵蚀着患者的健康。目前，异基因造血干细胞移植（Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation，alloSCT）是许多临床情况下唯一可能治愈 AML 的方法，但白血病复发却像高悬的 “达摩克利斯之剑”，成为移植后患者死亡的主要原因。alloSCT 的临床获益很大程度上依赖于移植物抗白血病（Graft-Versus-Leukemia，GVL）效应，然而，供体 T 细胞在发挥 GVL 效应的同时，还可能引发移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease，GVHD）。为了在不促进 GVHD 的情况下增强 GVL 效应，一种策略是过继转移针对白血病相关抗原（Leukemia-Associated Antigen，LAA）的细胞毒性 T 细胞（Cytotoxic T Lymphocytes，CTLs）。过继性细胞转移疗法（Adoptive Cell Transfer Therapy，ACT）在癌症治疗领域被寄予厚望，越来越多的 LAA 被确定为 ACT 治疗 AML 的靶点，如人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）等。不过，获取大量 LAA 特异性 CTLs 的困难却阻碍了这一治疗方式的临床应用。

在此背景下，宾夕法尼亚州立大学医学院宾夕法尼亚州立癌症研究所的研究人员展开了深入研究。他们利用一种新型树突状细胞（Dendritic Cell，DC）方法，成功从健康供体的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）中生成了 hTERT 特异性 CTLs。相关研究成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上。

研究人员开展这项研究运用了多种关键技术方法。在样本方面，收集了 AML 患者的外周血。实验中涉及多种细胞系，如通过特定方法构建表达 hTERT 的永生人 DC 系（ihv-DCs）等。同时，运用了 HLA 基因分型技术确定 HLA 类型，采用磁珠分选等技术纯化 CTLs，借助细胞毒性实验检测 CTLs 的杀伤能力，利用患者来源的异种移植（Patient-Derived Xenograft，PDX）模型评估 CTLs 在体内的抗白血病效果 。

下面来看具体的研究结果：

1. 用表达 hTERT 的 ihv-DCs 刺激 PBMCs 生成 CTLs：将 HLA-A2⁺健康供体的 PBMCs 与 ihv-DC-hTERT 共培养，发现细胞从 3 - 5 天开始显著生长并持续扩增。经流式细胞术分析，共培养过程中 CD8 T 细胞和 NK 细胞大量积累，而 CD4 T 细胞、B 细胞和单核细胞无明显扩增。进一步研究发现，培养过程中初始 T 细胞（T_N）亚群迅速减少，效应记忆 T 细胞（T_EM）快速增加并成为主要亚群。同时，细胞内转录因子 T-bet 和 eomesodermin（Eomes）上调，多数 CD8 T 细胞表达 Ki67，且细胞内颗粒酶 B 和穿孔素产生量高，表明成功生成了具有 CTL 表型的 CD8 T 细胞（CTL-hTERT）。
2. CTL-hTERT 在体外对表达 hTERT 的肿瘤和原发性 AML 细胞具有强大的细胞毒性：以 U20S 细胞系及其表达 hTERT 的 U20S-hTERT 细胞为模型，发现 CTL-hTERT 对 U20S-hTERT 细胞有强烈杀伤作用，对 U20S 亲本细胞杀伤作用极小，且添加 HLA-A2 阻断抗体可显著减弱杀伤作用。以急性单核细胞白血病细胞系 THP-1 为靶细胞，得到类似结果，CTL-hTERT 对 THP-1 细胞有显著细胞毒性，而未转导 hTERT 的 ihv-DC（ihv-DC-blank ctrl）刺激产生的 CTLs 对 THP-1 细胞杀伤作用较弱。对 11 例 HLA-A2⁺AML 患者的原代 AML 细胞检测发现，所有患者的白血病细胞（blasts）均表达 hTERT。CTL-hTERT 对原代 AML blasts 具有强大的细胞毒性，对非白血病细胞的 PBMCs 杀伤作用较小。
3. 过继转移 CTL-hTERT 可减少体内 AML 的生长：将 CTL-hTERT 过继转移到 PDX 模型中，该模型是将原发性 AML 细胞注入 NSG 小鼠构建而成。实验使用了来自体外实验相同供体 - 患者对的 CTLs 和 AML 细胞构建两种模型系统，结果显示，过继转移 CTLs 显著降低了骨髓中白血病细胞的百分比和绝对数量，在血液和脾脏中也呈现相同趋势。为进一步验证并模拟临床情况，研究人员建立了第三个模型，使用来自 HLA 匹配的无关 alloSCT 中供体和受体患者的 CTLs 和 AML 细胞，同样观察到 PDX 小鼠骨髓和血液中的肿瘤负荷显著降低。
4. CTLs 过继转移到 PDX 模型后，TIGIT 和 PD-1 表达上调：虽然过继转移 CTLs 显著降低了白血病负荷，但治疗结束后在所有检测器官中仍检测到残留白血病细胞。研究人员发现，在观察终点时，PDX 模型中存在持续的 CTLs。与转移前或转移到非 AML 对照小鼠的 CTLs 相比，转移到 PDX 模型（有 AML）的 CTLs 中，T_EMRA亚群频率显著增加。同时，CTLs 上 TIGIT 和 PD-1 的表达显著增加，这表明 CTLs 在与 AML 细胞接触后出现了耗竭，其增殖能力和杀伤能力下降。

研究结论和讨论部分指出，本研究利用新型 DC 方法成功生成了 hTERT 特异性 CTLs，这些 CTLs 在体外和体内均对 AML 细胞具有强大的细胞毒性，为改善 alloSCT 后 AML 复发的过继性 T 细胞转移治疗策略提供了有力支持。与其他治疗方法相比，本研究中使用的 ihv-DCs 具有诸多优势，如可体外扩增成为 “现成” 的细胞，组成性激活能支持 T 细胞增殖，还可工程化表达指定的肿瘤抗原。不过，该研究也存在一些需要进一步探索的地方。例如，需要确定 CTLs 的最佳剂量，以在最大限度发挥抗白血病作用的同时限制同种异体反应，从而减少 GVHD 的发生。此外，虽然 hTERT 特异性 CTLs 对 AML 治疗效果显著，但结合其他 LAA 靶点的 CTLs 或联合免疫检查点抑制剂，可能会进一步优化治疗策略。

总之，这项研究为 AML 的治疗开辟了新的道路，虽然仍有挑战，但也为后续研究指明了方向，有望为 AML 患者带来更多的治疗希望。